病毒性肝炎的病原檢測(cè)

病毒性肝炎的病原檢測(cè)李剛中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染病科

甲型肝炎⑴抗HAVIgM：病后數(shù)天即可陽(yáng)性，3～6月轉(zhuǎn)陰。是早期診斷甲型肝炎最簡(jiǎn)便而可靠的血清學(xué)標(biāo)志。⑵抗HAVIgG：出現(xiàn)稍晚，于2～3個(gè)月達(dá)到高峰，持續(xù)多年或終身?？笻AVIgG陽(yáng)性表示受過(guò)HAV感染。屬于保護(hù)性抗體，具有免疫力的標(biāo)志。穗港人群不同年齡抗HAVIgG陽(yáng)性率年齡廣州香港陽(yáng)性數(shù)/檢測(cè)數(shù)（%）陽(yáng)性數(shù)/檢測(cè)數(shù)（%）<1045/149（30.2%）3/51（5.8%）10~156/337（46.3%）10/84（11.9%）20~179/267（67.0%）21/91（23.1%）30~90/127（70.9%）67/94（71.3%）40~93/104（89.4%）344/414（83.1%）合計(jì)563/984（57.2%）445/734（60.6%）HBV基因及編碼蛋白乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)發(fā)展史推出年代檢測(cè)方法檢測(cè)下線評(píng)論1960放射免疫分析法pg,fg孵育時(shí)間長(zhǎng)，污染，不能全自動(dòng)化1970酶免疫分析法ng結(jié)果不穩(wěn)定,線性區(qū)間較小1980熒光/化學(xué)發(fā)光/增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ng,pg1996電化學(xué)發(fā)光pg最新,最先進(jìn)目前市場(chǎng)情況1大多采用酶免檢測(cè)方法

(1)1970酶免疫分析法ng水平(2)突變HBsAg的不能檢出或檢出能力明顯降低（3）E抗原無(wú)法定量(4)檢測(cè)周期長(zhǎng)2化學(xué)發(fā)光檢測(cè)逐漸增加

收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)已建立廣東:40元/T

乙型肝炎一、HBsAg與抗HBs

HBsAg在感染HBV兩周后即可陽(yáng)性。只要HBsAg陽(yáng)性就可診斷HBV感染，陰性則不能排除HBV感染。

抗HBs為保護(hù)性抗體，陽(yáng)性表示對(duì)HBV有免疫力。低滴度應(yīng)注意假陽(yáng)性。乙型肝炎HBsAg與抗HBs

HBV感染后可出現(xiàn)HBsAg和抗HBs同時(shí)陰性，即所謂窗口期，此時(shí)HBsAg已消失，抗HBs仍未產(chǎn)生，少部分病例始終不產(chǎn)生抗HBs。HBsAg和抗HBs同時(shí)陽(yáng)性可出現(xiàn)在HBV感染恢復(fù)期，此時(shí)HBsAg未消失，抗HBs已產(chǎn)生；另一情形是S基因區(qū)發(fā)生變異，野生株抗HBs不能將其清除；或抗HBs陽(yáng)性者感染了免疫逃避株。HBsAg定量稀釋度1:512

光密度S/CO

截止值COI

納克ng

HBsAg★化學(xué)發(fā)光:敏感性更高（0.03ng/mL），ELISA的10倍特異性更強(qiáng)檢測(cè)突變更出色精密度更高，小于5%；ELISA為20%

檢測(cè)線性范圍更廣，0.03～

400ng/mL

ELISA

0.2～

50ng/mLHBsAg★常用ELISA法檢測(cè)?！锬壳癏BsAg診斷試劑質(zhì)量較高，靈敏度可達(dá)0.2ng/L。從全國(guó)室間質(zhì)控評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，陽(yáng)性標(biāo)本檢出率達(dá)到或超過(guò)98％?！颒BsAg滴度越高，HBeAg、HBVDNA陽(yáng)性的可能性越大?！镅号c肝組織的HBsAg含量并不完全相關(guān)。為什么血清HBsAg陰性不能排除HBV感染？★檢測(cè)試劑不夠敏感。Abbott試劑盒由ad亞型抗體和抗原制備，對(duì)ay亞型的靈敏度較低?！颯基因變異（抗原性發(fā)生改變）?！颴基因變異（轉(zhuǎn)錄受抑制）?！镏丿BHCV感染（干擾HBsAg合成）。如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染？★提高檢測(cè)敏感性—表面等離子共振生物傳感—非競(jìng)爭(zhēng)性毛細(xì)管電泳—免疫傳感—納米磁性微球★采用針對(duì)變異抗原的檢測(cè)試劑★HBVDNA的檢測(cè)★組織中標(biāo)志物的檢測(cè)抗HBs?ELISA:半定量?電化學(xué)發(fā)光:2～

1000IU/L抗HBs陽(yáng)性就萬(wàn)無(wú)一失了嗎？?

低滴度應(yīng)注意假陽(yáng)性?單一抗HBs陽(yáng)性HBVDNA檢出率0-11.8%：

★先后感染了不同的HBV亞型

★S基因變異

★X基因變異

指示免疫應(yīng)答Anti－HBS(IU/l)接種的要求 <10立即11-1003-6月后101－10001年后1001－1000031/2年后>10000 7年后HBsAg與抗HBs共存★可出現(xiàn)在HBV感染的恢復(fù)期，此時(shí)HBsAg未消失，抗HBs已產(chǎn)生，大部分歸功于檢測(cè)敏感性的提高?！颯基因發(fā)生變異，野生株抗HBs不能將其清除；★抗HBs陽(yáng)性者感染了不同亞型HBV或免疫逃避株。基因變異導(dǎo)致HBsAg與抗HBs共存★aa126蘇氨酸絲、異亮氨酸★aa141賴(lài)氨酸谷氨酸★aa145甘氨酸精氨酸★前S1nt3025-3154缺失乙型肝炎

HBeAg與抗HBeHBeAg的存在表示病毒復(fù)制活躍且有較強(qiáng)的傳染性。HBeAg消失而抗HBe產(chǎn)生稱(chēng)為血清轉(zhuǎn)換?？笻Be陽(yáng)轉(zhuǎn)后，病毒復(fù)制多處于靜止?fàn)顟B(tài)，傳染性降低。但長(zhǎng)期抗HBe陽(yáng)性者并不代表病毒復(fù)制停止或無(wú)傳染性，研究顯示20%～50%仍可檢測(cè)到HBVDNA，部分可能由于前C區(qū)基因變異，導(dǎo)致不能形成HBeAg。HBeAg定量S/COCOIPEIU/mL(Paul-ErlichInstitute)HBeAg

★是重要的免疫耐受因子，大部分情況下其存在表示患者處于高感染低應(yīng)答期。

★HBeAg與HBVDNA有良好的相關(guān)性。★陽(yáng)性標(biāo)本HBVDNA檢出率90％左右。HBeAg水平與HBVDNA的關(guān)系★HBeAg0.28～134PEIU/L,HBVDNA5.58±1.84e

。

★HBeAg＞134PEIU/L,HBVDNA6.93±1.03e。HBeAg陰性/抗HBe陽(yáng)性，HBVDNA陽(yáng)性HBV感染

★HBVDNA水平一般較低?！?0%以上由于nt1896位突變引起。乙型肝炎

HBcAg與抗HBc

HBcAg陽(yáng)性表示血清中存在Dane顆粒，HBV處于復(fù)制狀態(tài)，有傳染性。常規(guī)不作為檢測(cè)項(xiàng)目抗HBcIgM是HBV感染后較早出現(xiàn)的抗體，絕大多數(shù)出現(xiàn)在發(fā)病第一周，多數(shù)在6個(gè)月內(nèi)消失。高滴度的抗HBcIgM對(duì)診斷急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎急性發(fā)作有幫助。抗HBcIgM

>100PEIU/mL急性<100PEIU/mL慢性乙型肝炎抗HBc抗HBcIgG絕大部分HBV感染者為陽(yáng)性，因?yàn)镠BcAg的抗原性很強(qiáng)。

單一抗HBcIgG陽(yáng)性者可以是過(guò)去感染，因其可長(zhǎng)期存在；亦可以是低水平感染，特別是高滴度者?？笻Bc陰性的原因

★免疫耐受。★檢測(cè)試劑原因，目前試劑準(zhǔn)確性約85%。★C區(qū)突變。

HBVDNA檢測(cè)的臨床意義⒈診斷方面：⑴HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)⑵HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志⑶HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBVDNA檢測(cè)的臨床意義

⑷對(duì)HBV-M起補(bǔ)充作用：①HBeAg(﹣)/抗HBe(﹢)乙型肝炎（前C區(qū)變異）②HBsAg(﹣)乙型肝炎（S區(qū)變異）③低水平感染單項(xiàng)抗HBc(﹢)乙型肝炎

HBVDNA檢測(cè)的臨床意義⒉療效判斷：HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)

HBVDNA1IU=5copies100IU=500copiesHCVRNA1IU=2copies100IU=200copiesHBVDNA1IU=5.3copies(Amplicor)1IU=5.6copies(Versant)1IU=5.8copies(TaqMan)HBVDNA500copies=

95.1IU(Amplicor)=89.3IU(Versant)=86.2IU(TaqMan)

=5X10-4MEq=2.7Log10copiesHBVDNA1000copies=190IU(Amplicor)=179

IU(Versant)=172IU(TaqMan)

=1X10-3MEq=3.0Log10copies

HBVDNA檢測(cè)下限國(guó)產(chǎn)500～1000copies進(jìn)口50～

200copiesHCVRNA檢測(cè)下限國(guó)產(chǎn)1000～2000copies進(jìn)口100copiesHBVDNA檢測(cè)方法⒈雜交

⒉定性PCR（基本淘汰）

⒊定量PCR（主流）⒋基因芯片（將來(lái)？）HBVDNA檢測(cè)方法的比較

斑點(diǎn)雜交PCR定量PCR敏感性105102102特異性高稍低高重復(fù)性好稍差好定量范圍466簡(jiǎn)便較繁瑣簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便安全性好好好設(shè)備便宜稍貴昂貴技術(shù)要求低高高檢測(cè)價(jià)格低中高基因芯片

陽(yáng)性參照熒光信號(hào)值大于35000，探針10位置處的熒光信號(hào)值為3378、3228，探針14位置處的熒光信號(hào)值為12643、11498，探針16位置處的熒光信號(hào)值為16278、16595，探針17位置處的熒光信號(hào)值為52009、53246，探針18位置處的熒光信號(hào)值為3876、4550，陰性對(duì)照熒光信號(hào)值均小于400，空白對(duì)照處熒光信號(hào)值小于50。此反應(yīng)區(qū)的結(jié)果判讀為HBVDNA(+)、HCVRNA(+)、YVDD變異和HCV1b＋3b型。芯片掃描結(jié)果芯片信號(hào)強(qiáng)度和HBVDNA定量檢測(cè)結(jié)果的比較血清編號(hào)芯片信號(hào)平均值定量檢測(cè)結(jié)果81039851018518686618865608679981212810018076581668818238306683072830768475285149825538242682938829391811024069174861777121725230221461111759164371615415195131731607312899104301348287958369878183691.01×1092.97×1091.08×1091.35×1091.42×1091.73×1093.82×1071.68×1075.96×1073.28×1073.24×1072.97×1074.38×1071.90×1072.30×1073.19×1075.07×1052.46×1056.24×1053.79×105

基因芯片與HBVDNA定量檢測(cè)HBV結(jié)果比較基因芯片陽(yáng)性陰性

陽(yáng)性194HBVDNA定量陰性215符合率為85%(34/40)，芯片檢出率為82.61%(19/23),假陽(yáng)性率為11.76%(2/17).

芯片檢測(cè)HBVYMDD變異株與測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果的比較標(biāo)本編號(hào)基因芯片法DNA測(cè)序法1234567891011121314151617181920YVDDYMDDYVDDYVDDYVDD+YIDDYIDDYMDDYMDD+YVDD+YIDDYVDDYVDDYVDD+YIDD未檢出YVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDD+YIDDYVDDYVDDYMDDYVDDYVDDYVDDYIDDYMDDYMDDYVDDYVDDYIDDATG→ATAYVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDDYVDD

基因芯片與錯(cuò)配PCR檢測(cè)YMDD變異株結(jié)果比較基因芯片陰性YMDDYVDDYIDD混合

錯(cuò)陰性

30000配YMDD1

3

11

2PCRYVDD12

5

00YIDD00001混合00000

5份芯片檢測(cè)的標(biāo)本與DNA序列測(cè)定結(jié)果一致

我科1474例HBV-M與HBVDNA結(jié)果分析

HBsAgHBeAgHBcAbHBsAbHBeAb例數(shù)HBVDNA(+)

例數(shù)(%)1+++--603520（86.2）2+-+-+465163（35.1）3++---1918（94.2）4+-+--21688（40.7）5+---+53（60）6--+++201（5）7--++-271（3.7）8--+-+242（8.0）9---++10（0）10---+-562（3.6）11--+--263（11.5）12++++-22（100）13-----100（0）合計(jì)1474803

注：數(shù)據(jù)引自陳雪娟論文乙型肝炎組織中HBV標(biāo)志物的檢測(cè)可用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織中HBsAg、HBcAg的存在及分布；原位雜交或原位PCR方法檢測(cè)組織中HBVDNA的存在及分布。除可判定病毒是否處于復(fù)制狀態(tài)外，對(duì)血清中HBV標(biāo)志物陰性病人的診斷有一定意義。HBV基因型的檢測(cè)

PCR(SNP,RFLP

)

序列測(cè)定

基因芯片耐藥的位置和檢測(cè)LVD:M204I/VADV:N236T和/或A181VETV：(1)M250V或I169T或S202I/G或T184G/A/I/S(2)M204VI+(1)L-dT:M204I/V拉米夫定恩替卡韋替比夫定阿德福韋V173LL180MA181VA184GS202IM204IM204VN236TM250VYangetalHepatology2003;38:705ALaietalHepatology2003;38:262AColonnoetal43rdICAAC;Abst#V-786LeungetalHepatology2001;34:349A耐藥變異株檢測(cè)方法核苷酸序列測(cè)定法(PCR產(chǎn)物直接測(cè)序)(準(zhǔn)種池20%)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)5%實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)10%聚合酶鏈反應(yīng)微板核酸雜交-酶聯(lián)免疫黏附法(PCR-ELISA)基因芯片技術(shù)(microarray)反向雜交法(INNO-LiPA)5%-10%基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOFMS)1%

芯片檢測(cè)HBVYMDD變異株與測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果的比較標(biāo)本編號(hào)基因芯片法DNA測(cè)序法1234567891011121314151617181920YVDDYMDDYVDDYVDDYVDD+YIDDYIDDYMDDYMDD+YVDD+YIDDYVDDYVDDYVDD+YIDD未檢出YVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDD+YIDDYVDDYVDDYMDDYVDDYVDDYVDDYIDDYMDDYMDDYVDDYVDDYIDDATG→ATAYVDDYVDDYVDDYV