基因工程-第四章 目的基因的分離與修飾

第四章目的基因的分離與修飾Chapter4PreparationamdModificationsofTargetGene第一節(jié)基因的基本結(jié)構(gòu)特征（CharacterofGeneBasicStructure）作為一個具有功能的結(jié)構(gòu)基因應(yīng)具備下列的元件：轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)核糖體識別區(qū)編碼區(qū)（包括起始密碼子）開發(fā)閱讀框終止密碼子轉(zhuǎn)錄終止區(qū)一、原核生物基因的組成（CompositionofprokaryoticGene）1.1基因區(qū)：原核生物的基因多數(shù)以操縱子（Operon）形式存在，操縱子中的各個基因分別有各自的起始密碼子和終止密碼子。1.2啟動區(qū)：包括－35區(qū)和－10區(qū)1.3SD區(qū)：在起始密碼子ATG上游約10bp，富含嘌呤的保守區(qū)，與16SrRNA結(jié)合。1.4轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子原核生物基因的組成基因區(qū)：多以操縱子形式存在，多順反子mRNA啟動區(qū)（promoter）：DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，轉(zhuǎn)錄開始的部位。SD區(qū)：位于AUG上游4~13個NT處的富含嘌呤的序列，為AGGAGG。與16SrRNA的3’端(3’-UCCUCC-5’）,使AUG定位在P位。轉(zhuǎn)錄起點-35-10轉(zhuǎn)錄終止子(terminator)強終止子，也稱為內(nèi)部終止子。弱終止子，又稱為ρ依賴終止子。二、真核生物基因的組成（CompositionofEukaryoticGene）2.1基因區(qū)：真核生物的基因含有內(nèi)含子（Intron）和外顯子（Exon）。1.2轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)：包括TATA框，CAAT框和GC框1.3Kozak區(qū)：

GCCACCATGG

1.4轉(zhuǎn)錄終止子真核生物基因的組成基因區(qū)：

割裂基因，外顯子，內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)單順反子mRNA轉(zhuǎn)錄終止子三、其他基因組基因的組成質(zhì)粒的基因：不含內(nèi)含子病毒的基因：以多順反子進行轉(zhuǎn)錄；有重疊基因；線粒體的基因：以多順反子進行轉(zhuǎn)錄；無SD序列；葉綠體的基因：以多順反子進行轉(zhuǎn)錄，含有類似于原核基因組的啟動子和SD序列四、基因的排列基因組中的基因一個接一個排列在DNA分子上，基因之間存在長度不等的間隔區(qū)，但某些生物基因組中的基因存在重疊、重復(fù)、加倍和重排等現(xiàn)象。重疊基因重復(fù)基因原核生物無重復(fù)序列低等真核生物10-20%高等植物80%高等動物50%重復(fù)基因加倍基因高等生物含倍性染色體，基因組為多倍。原核生物的單倍，質(zhì)粒是多拷貝的1目的基因2目的基因的制備3目的基因的分離2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術(shù)分離目的基因2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術(shù)擴增目的基因2.6化學(xué)合成基因2.1直接分離法-限制性內(nèi)切核酸酶酶切法該法適于從簡單基因組中分離目的基因，如質(zhì)粒和病毒等DNA。BamHI和EcoRI酶切，可獲得目的基因。對于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達數(shù)萬個，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個目的基因在整個基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。為了解決這個難題，一種可行的方法就是將這個基因擴增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對它進行特異性擴增，只能對所有的基因進行擴增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因。1）概念：基因文庫(genelibrary)：指某一生物類型全部基因的集合。以重組體形式出現(xiàn)。基因文庫由外源DNA片段、載體和宿主組成。一個理想的基因文庫應(yīng)包括該生物染色體基因組全部遺傳信息(即全部DNA序列)。2.2基因文庫技術(shù)分離目的基因用途：

a）分離有用的目的基因

b）保存某種生物的全部基因2)基因文庫構(gòu)建的基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②載體的選擇及制備。③DNA片段或cDNA與載體連接。④重組體轉(zhuǎn)化宿主細胞。⑤轉(zhuǎn)化細胞的篩選。限制性內(nèi)切酶……克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫基因文庫技術(shù)分離目的基因----未知基因

基因的克?。韩@得含重組DNA的宿主細胞克隆基因的分離:從文庫中分離出目的基因分離基因的鑒定:確定基因的結(jié)構(gòu)及功能

3）基因文庫的類別基因組文庫與cDNA文庫基因組文庫：指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的DNA片段克隆到某種載體上而形成的集合?；蚪M文庫分為：核基因組文庫、葉綠體基因組文庫及線粒體基因組文庫。cDNA文庫：是指某生物基因組轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補DNA。結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術(shù)分離目的基因2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術(shù)擴增目的基因2.6化學(xué)合成基因2.3.1基因組文庫的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫的構(gòu)建2.3.3考斯質(zhì)?；蚪M文庫的構(gòu)建2.3.4YAC基因組文庫的構(gòu)建2.3基因組文庫的構(gòu)建2.3.1基因組文庫(Genomiclibrary)的概念和大小概念：基因組文庫：某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲存于某一受體菌的群體中。基因組DNA文庫的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。一個理想的基因組文庫要有足夠多的克隆子數(shù)，保證所有的基因都在克隆子群體中。以某生物基因組約3

106kb，酶切片段平均長度15kb。理論克隆數(shù)：

基因組DNA總長

DNA片段平均長度

3

106/15=2

105基因組文庫的大小實際克隆數(shù)：DNA片段是隨機克隆的，因此理論值只是基因組文庫所需要的最小數(shù)值。一個完全的基因文庫就必須含有更多的重組體克隆數(shù)。

文庫理論克隆子數(shù)＝以上的例子，N值應(yīng)是：ｌｎ（１－0.99）ｌｎ[1-（15/3

106

）]

1975年，L.Clark和J.Carbon的經(jīng)驗公式：文庫實際克隆子數(shù)N＝ｌｎ（１－ｐ）ｌｎ（１－ｆ）N:基因組文庫必需的克隆子數(shù)；P:文庫中目的基因出現(xiàn)的機率，一般情況下期望值99％，即0.99?:分離的DNA片段平均大小與基因組大小的比值。一個完全的基因文庫必須含有3-10倍于最低重組體克隆數(shù)的克隆。

N==9

1053

106/15=2

105基因組文庫應(yīng)具有的克隆子數(shù)基因組DNA文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一個理想的基因組DNA文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選2.2.1基因組文庫的概念和大小2.2.2λ噬菌體基因組文庫的構(gòu)建2.2.3考斯質(zhì)?；蚪M文庫的構(gòu)建2.2.4YAC基因組文庫的構(gòu)建2.2基因組文庫構(gòu)建連接克隆載體的選擇質(zhì)粒載體可承載15kbDNA片段

載體可承載23kbDNA片段

Cosmid載體可承載45kbDNA片段

YAC文庫4000kbBAC文庫300kb利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫該法簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。1）載體的特點：λ噬菌體是一種溫和噬菌體，可保存在大腸桿菌中。承載較大外源DNA，約23kb。有多種限制酶識別位點。

2.2.2構(gòu)建λ噬菌體基因組文庫獲得含目的基因的DNA片段與λ噬菌體載體重組重組DNA的包裝轉(zhuǎn)化受體菌2）構(gòu)建λ噬菌體基因組文庫的步驟重組克隆的挑選和保存目的基因DNA片段化方法：超聲波處理限制性內(nèi)切酶部分酶切A機械切割法（超聲波處理）：優(yōu)點：可獲得較均一的隨機片段，缺點：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，需經(jīng)末端修飾，連上接頭后再用限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生黏性末端。B限制酶消化：選用四或六核苷酸的限制性內(nèi)切酶，如：（GATC）Sau3AI或MboI、BamHI(GGATCC)等。優(yōu)點：直接產(chǎn)生黏性末端，缺點：片段的隨機性較差。基因組DNA的不完全酶切確定限制酶用量，改變酶切時間固定酶切時間，改變限制酶的用量載體的結(jié)構(gòu)左臂：編碼噬菌體頭部和尾部蛋白的基因右臂：復(fù)制起始點、轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)和其它必須基因左臂和右臂末端的Cos位點中央片段：不含必須基因基因文庫

Sau3AI或MboI密度梯度離心或電泳重組DNA分子的包裝:

a.λDNA的包裝物的制備:

使用的大腸桿菌菌株：

E.coliBHB2688-包裝蛋白

E.coliBHB2690-頭部蛋白

b.重組λDNA分子的包裝過程包裝制備物（-70℃）于冰上緩慢融化加入重組λDNA分子邊融化邊混合邊包裝離心除去細胞碎片λ顆粒于-70℃保存待用5)基因組文庫的保存

包裝的λ顆粒感染E.coli

培養(yǎng)分離λ顆粒-70℃保存DNA片段之間的連接具互補黏性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接

DNA片段末端修飾后進行連接

DNA片段加連桿或銜接物后連接回顧（1）具互補黏性末端片段之間的連接基本原理：

DNA連接酶連接具有互補粘性末端DNA片段?；仡櫍?）具平末端DNA片段之間的連接基本原理：直接用T4DNA連接酶連接.

回顧（3）DNA片段末端修飾后進行連接1)DNA末端同聚物加尾后進行連接回顧2)黏性末端修飾成互補粘端或平末端后進行連接①修平：用核酸酶切除雙鏈DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4連接酶作平末端連接。②補平：用Klenow酶將粘端補平，產(chǎn)生平末端或匹配粘端，再用T4連接酶進行連接?；仡?)DNA片段5’端脫磷酸化后連接基本原理：堿性磷酸酶催化去除DNA的5’磷酸根，防止DNA的自身環(huán)化或連接形成多聚體?；仡櫍?）DNA片段加連桿或銜接物后連接

連桿(linker)：指用化學(xué)方法合成的一段由10-12個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的寡核苷酸片段?；仡橠NA銜接物（adaptor）：由化學(xué)合成的一端具有某種限制酶的粘性末端而另一端為平末端的雙鏈寡聚核苷酸短片段。回顧2.3.1基因組文庫的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫的構(gòu)建2.3.3考斯質(zhì)?；蚪M文庫的構(gòu)建2.3.4YAC基因組文庫的構(gòu)建

2.3基因組文庫構(gòu)建基因文庫

Sau3AI或MboI2.3.3構(gòu)建考斯質(zhì)?；蚪M文庫1）特點：優(yōu)點：具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可在細菌中保存和大量復(fù)制。含有Cosmid位點，可進行體外包裝；克隆容量很高，45kb，載體的分子較小，在10kb以下。2）基因組文庫的構(gòu)建過程缺點：篩選困難；重組效率低；文庫不易保存。2.3.1基因組文庫的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫的構(gòu)建2.3.3考斯質(zhì)?；蚪M文庫的構(gòu)建2.3.4YAC基因組文庫的構(gòu)建

2.3基因組文庫構(gòu)建2.3.4構(gòu)建YAC基因組文庫1）載體的特點：YAC載體的基本組成部分：*自主復(fù)制序列(ARS)*著絲粒序列（CEN）*端粒序列（TEL）*選擇標(biāo)記基因*多克隆位點（MCS）優(yōu)點：承載長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段，2）基因組文庫的構(gòu)建過程2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術(shù)分離目的基因

2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術(shù)擴增目的基因2.6化學(xué)合成基因2.4cDNA基因文庫的構(gòu)建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫的概念cDNA文庫：是指某生物基因組轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。2.4.2cDNA基因文庫的構(gòu)建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫大小的關(guān)系2.4.4cDNA克隆的優(yōu)越性2.4.2cDNA基因文庫的構(gòu)建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導(dǎo)入大腸桿菌宿主細胞增值。mRNA的提取全長mRNA具有一個polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分離；用寡聚纖維素柱，選擇性地吸附mRNA純化①分離細胞總RNA，從中分離純化mRNA；②合成cDNA的第一條鏈：

a.oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法：原理：真核mRNA分子具有poly(A)尾巴，加入oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。缺陷：逆轉(zhuǎn)錄酶通常無法到達mRNA分子的5’-末端，必須從3’-末端開始合成cDNA。b.隨機引物引導(dǎo)的cDNA合成法：原理：隨機引物：人工合成的含有各種可能的排列順序的六核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸片段雜交，并作為聚合酶反應(yīng)的引物。應(yīng)用這種混合引物，cDNA的合成從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，從而保證得到mRNA的編碼區(qū)和5’端旁側(cè)。多用于mRNA分子較大且3’端非編碼區(qū)序列較長；AAAAAAAAAAAA3’

5’3’2.4.2cDNA基因文庫的構(gòu)建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導(dǎo)入大腸桿菌宿主細胞增值。③合成cDNA第二條鏈a.自身引導(dǎo)合成法b.大腸桿菌RNaseH酶降解取代法c.oligo(dG)寡聚引物引導(dǎo)法d.PCR法

a.自身引導(dǎo)合成法：原理：單鏈cDNA的3’端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶I、Klenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點：S1核酸酶切割發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)會丟失對應(yīng)于mRNA5’端的序列。

S1核酸酶偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。b.大腸桿菌RNaseH酶降解取代法-置換合成法原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA-mRNA作為切口平移的模板，

RNA酶H對mRNA造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，大腸桿菌DNA聚合酶I

的作用下合成cDNA的第二鏈。優(yōu)點：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNAc.oligo(dG)寡聚引物引導(dǎo)法oligo(dG)作為引物可與cDNA第一鏈3’末端的poly(T)序列相結(jié)合，有效的引發(fā)cDNA第二鏈的合成。d.RCR法

以cDNA的第一條鏈為模板設(shè)計引物。優(yōu)點：可獲得多拷貝的雙鏈cDNA;不用純化mRNA;同聚物尾巴保護末端.

2.4.2cDNA基因文庫的構(gòu)建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導(dǎo)入大腸桿菌宿主細胞增值。④cDNA與載體的重組后導(dǎo)入大腸桿菌宿主細胞增值。

cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對雙鏈cDNA的末端進行加工.方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端末端轉(zhuǎn)移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補的尾部2.4cDNA基因文庫的構(gòu)建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫的概念2.4.2cDNA基因文庫的構(gòu)建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫大小的關(guān)系2.4.4cDNA克隆的優(yōu)越性2.4.3mRNA豐度和cDNA基因文庫大小的關(guān)系cDNA文庫中儲存某種基因的概率與總mRNA中這種基因的mRNA的拷貝數(shù)有關(guān)。某種mRNA的拷貝數(shù)越多，意味著cDNA文庫中儲存該基因的概率越大，越容易分離出來。

某種mRNA在不同組織不同發(fā)育時期的豐度不同。

mRNA的豐度與文庫克隆子數(shù)的關(guān)系

N=ln(1-P)/ln(1-f)N:所需克隆數(shù);P:要求的概率;f:一種mRNA的豐度與總mRNA的比值哺乳動物細胞含有10,000-30,000種不同的mRNA分子，某些mRNA分子的拷貝數(shù)很低甚至只有一個拷貝。要富集或增大克隆數(shù)目來保證構(gòu)建的文庫中能夠含有它們的克隆。1)按大小對mRNA進行分級分離通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子,該方法的分離效果最好，但從凝膠中回收的得率較低.蔗糖梯度離心：分離不同分子量的mRNA.2)cDNA的分級分離*mRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開來。*優(yōu)點：

a）避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解

b）增加了獲得全長cDNA克隆的概率

c）獲得更準(zhǔn)確的分級分離效果（分子量）3）多聚核糖體免疫學(xué)純化法使用抗體純化合成目的多肽的多聚核糖體。將正在合成的新生多肽鏈的多聚核糖體結(jié)合到免疫親和柱上，隨后用EDTA將多聚核糖體解離下來，并通過Oligo(dT)層析分離mRNA,利用該方法可將目的mRNA純化數(shù)千倍。2.4cDNA基因文庫的構(gòu)建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫的概念2.4.2cDNA基因文庫的構(gòu)建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫大小的關(guān)系2.4.4cDNA克隆的優(yōu)越性2.4.4cDNA克隆的優(yōu)越性①cDNA文庫以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。②cDNA文庫的篩選比較簡單易行。③每一個cDNA文庫都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率就會比較低，因此陽性雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會含有目的基因。④cDNA文庫可用于在細菌中能進行表達的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。⑤cDNA克隆還可用于真核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。局限性：1）cDNA文庫包含的遺傳信息比基因組文庫的少，且受細胞來源或發(fā)育時期的影響。2）不能直接獲得基因的內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面的信息。3）分離到的多為高豐度mRNA的產(chǎn)物。2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術(shù)分離目的基因

2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術(shù)擴增目的基因2.6化學(xué)合成基因PCR，PolymeraseChainReaction

（1）反應(yīng)體系：含有目的基因或序列的DNA模板熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）一對脫氧寡核苷酸引物（primer）4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)Buffer及Mg2+等5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

5

5

5

5

5

5

（2）基本工作原理Cycle35

5

5

5

5

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5

5

5

5

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5

5

5

5

5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。（3）PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C如果知道目的基因的全序列或其兩側(cè)的序列，可以合成一對與模板DNA互補的引物，利用PCR技術(shù)擴增出含目的基因的DNA片段。2.5利用PCR擴增目的基因局限性：必須知道側(cè)接靶序列的核苷酸序列，以制備引物。常規(guī)PCR擴增片段一般在lkb以內(nèi)。未知序列的目的基因和大片段基因的擴增，則需要特殊類型的PCR

：套式PCR、反向PCR、不對稱PCR、多重PCR、錨定PCR、長程PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和原位PCR等。1）Nestedpcr （套式PCR）特點:

需要設(shè)計兩對引物，一對引物擴增稍長片段，在這一擴增范圍內(nèi)再設(shè)計一對引物，擴增的產(chǎn)物是以第一對引物的產(chǎn)物為模版套式PCR

通過內(nèi)外引物進行兩次擴增，大大提高了檢測的敏感性2）反向PCR（InversePCR）基本原理：擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，在引物外側(cè)合成DNA。已知序列未知序列未知序列連接酶3）不對稱PCR

目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。

高濃度引物低濃度引物以其中的mRNA作為模板，以O(shè)ligo（dT）或隨機引物或基因特異性為引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達

4）RT-PCR:提取組織或細胞中的總RNA5）多重PCR：在一個反應(yīng)體系中使用一對以上引物的PCR稱，其結(jié)果是產(chǎn)生多個PCR產(chǎn)物，用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物6）原位PCR原位雜交PCR首先將樣品組織切片或細胞涂片，然后固定在載玻片上；適當(dāng)預(yù)處理后，將細胞核內(nèi)的DNA加熱變性形成兩條單鏈DNA。針對待檢測的選定序列設(shè)計一對引物，直接將引物dNTP緩沖液及TaqDNA聚合酶加到載玻片上在原位聚合酶儀內(nèi)進行PCR擴增反應(yīng)完畢后將PCR產(chǎn)物固定在載玻片上用相應(yīng)的檢測信號系統(tǒng)進行檢測?？梢詸z測組織細胞中微量DNA或RNA，且可精確定位人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片7）定量PCR：熒光實時定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。常用的熒光標(biāo)記方法：非特異檢測——雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；代表是SYBRGreenI熒光染料擴增序列專一檢測——主要指TaqMan熒光探針熒光染料技術(shù)成本低廉，實驗設(shè)計簡便；而探針雜交技術(shù)在原理上嚴格，所得數(shù)據(jù)特異性高、更為精確SYBRGreenI工作原理：

SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。單鏈DNA、變性DNA:無熒光信號GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAATaqMan探針法： 指PCR擴增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針：該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報告基團(Reporter,R)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(Quencher,Q。當(dāng)探針完整的時候，5′端報告基團經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團所激發(fā)的熒光信號與目標(biāo)序列互補

PCR擴增過程中：Taq酶在鏈延伸時遇到與模板結(jié)合的探針，其5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）就會將切割探針釋放5′端報告基團游離于反應(yīng)體系中，遠離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，5′端報告基團受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號就可以被探頭檢測到。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術(shù)分離目的基因

2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術(shù)擴增目的基因2.6化學(xué)合成基因2.6化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列基因的化學(xué)合成20世紀70年代，Khorana提出，

提出體外擴增DNA1922-）印度-美國化學(xué)家遺傳密碼的破譯，獲得1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。DNA合成儀的基本工作原理是：將要合成的DNA片段3’端的第一個核苷酸固定于不溶性載體上．該核苷酸開始與另一核苷酸進行縮合反應(yīng)，形成二核苷酸分子通過酸或堿洗脫其一端的保護基團，再次與另一個5’或3’保護的核苷酸分子進行第二次縮合反應(yīng)，形成三核苷酸分子；再用同樣的步驟與下一個核苷酸進行循環(huán)反應(yīng)。每循環(huán)反應(yīng)一次就接長一個核苷酸，一般一個循環(huán)只需幾分鐘。接長的鏈?zhǔn)冀K被固定在不溶的固相載體上，合成結(jié)束后，將寡核苷酸鏈從固相載體上洗脫下來?；瘜W(xué)合成法優(yōu)缺點優(yōu)點：準(zhǔn)確性極高，合成速度較快缺點：合成的寡核苷酸鏈長度短(不大于80個堿基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探針、人工接頭、較小基因的合成。對于超過該法合成范圍的寡核苷酸鏈的合成，可采用分段合成法，再連接組裝成完整的基因。圖1基因合成的全片段酶促連接法圖2基因合成的酶促填充法2目的基因的制備直接分離法基因文庫技術(shù)分離目的基因基因組文庫分離法

cDNA基因文庫分離

PCR技術(shù)擴增目的基因化學(xué)合成基因基因文庫和cDNA文庫的建立組織可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA長度分級甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接引入大腸桿菌鑒定文庫的克隆數(shù)和特性擴增后供長期儲存篩選出所需要的克隆從中分離出目的基因基因文庫技術(shù)分離目的基因

基因的克?。韩@得含重組DNA的宿主細胞克隆基因的分離:從文庫中分離出目的基因分離基因的鑒定:

確定基因的結(jié)構(gòu)及功能

測序自動測序儀功能分析預(yù)測軟件1目的基因2目的基因的制備3目的基因的分離基因文庫的篩選和基因分離：在成千上萬的克隆中僅極少數(shù)含目的基因，且大多數(shù)基因的產(chǎn)物不具有可選擇的表型特征，如何篩選？：(1)用特異探針進行分子雜交；(2)用免疫和生化方法來檢測基因產(chǎn)物；(3)用特異性引物進行PCR擴增。雜交：親緣關(guān)系很近的不同來源的DNA單鏈或RNA單鏈與DNA單鏈之間通過堿基互補形成雜交分子的過程。分子雜交分子探針標(biāo)記核酸分子探針：用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記一小段已知核苷酸序列作為探針，探針的序列如果與DNA或RNA序列互補，就可以探知核酸分子。粗線表示分子探針檢測方法：同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、顏色標(biāo)記平板雜交/菌落雜交技術(shù)3目的基因的分離3.1編碼產(chǎn)物已知的目的基因3.2編碼產(chǎn)物未知的目的基因3目的基因的分離3.1編碼產(chǎn)物已知的目的基因根據(jù)特異蛋白分離目的基因氨基酸順序反推核苷酸序列蛋白免疫反應(yīng)功能互補法分離基因根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因3.2編碼產(chǎn)物未知的目的基因3.1已知編碼產(chǎn)物的目的基因分離3.1.1根據(jù)特異蛋白分離目的基因功能克隆法：依賴于基因表達產(chǎn)物及其生物功能進行基因克隆。①分析特異蛋白質(zhì)中氨基酸順序，合成寡核苷酸探針，從文庫中分離出相應(yīng)基因。如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽

對應(yīng)mRNAQUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCNN=ACGT/U探針序列

CAN-AAP-GTP-CTP-CGQ=CT/UP=AG32種14聚體混合物，其中必有一種14聚體與待測DNA完全互補利用這種方法首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產(chǎn)物②制備特定的蛋白質(zhì)抗體及蛋白質(zhì)功能檢測，篩選相應(yīng)的基因。待分離基因的表達產(chǎn)物—蛋白質(zhì)純化和制備出相應(yīng)抗體。再用特異的蛋白質(zhì)抗體篩選含有目的基因的cDNA表達文庫，分離含目的基因的克隆。局限性：特異蛋白必須是已知且分離純化的。將菌落或噬菌斑原位復(fù)制到膜上處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育漂洗未結(jié)合的抗體，加入經(jīng)標(biāo)記的第二抗體能與第一抗體結(jié)合3.1.2功能互補法分離基因基本原理：利用被克隆的DNA片段與寄主細胞的染色體DNA在功能上有同源互補性來分離基因。例如：營養(yǎng)缺陷型互補基因。實例：基因組文庫DNA→

轉(zhuǎn)化釀酒酵母細胞（leu2,Leu-）→轉(zhuǎn)化細胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因Leu2(基因型),Leu-（表型）營養(yǎng)缺陷型特點：在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長3.1.3根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因基本原理：從DNA序列數(shù)據(jù)庫（Genbank

等）中查找有關(guān)基因的序列，以此為核酸探針進行雜交篩選。對雜交后的陽性克隆子重組DNA進行測序，與已知基因的核苷酸序列進行比較和鑒定，確定是否是待分離的目的基因。舉例：菠菜的基因組中尋找耐受重金屬基因?qū)?yīng)mRNAAUC-GUG-UUA-CAU-GAA-GCA

（擬南芥/水稻的Genbank

）探針序列

TAG-CAC-AAT-GTA-CTT-CGT

缺陷：分離的基因一般不是新的基因。3目的基因的分離3.1編碼產(chǎn)物已知的目的基因根據(jù)特異蛋白分離目的基因氨基酸順序反推核苷酸序列蛋白免疫反應(yīng)功能互補法分離基因根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因3.2編碼產(chǎn)物未知的目的基因3.2編碼產(chǎn)物未知的基因分離采用特殊手段獲得探針，再從文庫中分離；差別雜交(differentialhybridization)，減法雜交（subtractivehybridization）DNA標(biāo)簽法，也叫DNA插入誘導(dǎo)法mRNA差別顯示技術(shù),DD-PCR酵母雙雜交系統(tǒng)染色體步查法3.2.1差別雜交法基本原理：利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，用于分離克隆新基因；分別制備兩種細胞群體的mRNA提取物，以這兩種總mRNA（或其cDNA)，分別篩選由表達目的基因的細胞群體構(gòu)建的cDNA文庫。舉例：分離受生長因子調(diào)節(jié)的基因1）構(gòu)建的cDNA文庫涂鋪在平板上2）一式兩份轉(zhuǎn)至膜上。3）用血清刺激的和未刺激的細胞的po1y(A)RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備放射性標(biāo)記的總cDNA探針4）分別與已轉(zhuǎn)移噬菌體DNA的膜雜交5）通過對雜交結(jié)果的仔細對比分析，可以找到那些僅與血清刺激細胞總cDNA探針雜交的或雜交信號明顯強烈的克隆，它們代表了血清誘導(dǎo)表達的mRNA。根據(jù)目的基因特異性表達進行分離：有的基因只有在某生物的一定的生長發(fā)育階段或一定的器官中才能表達。例如，待分離的目的基因只有在植物的根中才能有效表達，而在其他器官中(如植物的葉)不能表達。因此用根構(gòu)建的cDNA文庫中含有攜帶目的基因cDNA的克隆子，而用葉構(gòu)建的cDNA文庫中不含攜帶目的基因cDNA的克隆子。根據(jù)這一性質(zhì)以根和葉的總mRNA(或它們的cDNA)為探針，分別對兩種cDNA文庫進行雜交比較(圖)。用根的總mRNA(或它們的cDNA)制備的探針對這兩個cDNA文庫進行雜交時，所有克隆子都呈陽性反應(yīng)；而用葉的總mRNA(或它們的cDNA)制備的探針進行雜交時，葉cDNA文庫中的所有克隆子都呈陽性反應(yīng)，根cDNA文庫中的某些克隆子呈陰性反應(yīng)。最后比較4份雜交結(jié)果，便可以在根cDNA文庫轉(zhuǎn)膜的大量菌落中挑選出含目的基因的菌落。分離特定組織中表達的基因差示雜交法的特點：不需要知道目的基因的序列特別適用于分離在特定組織中表達的基因特定發(fā)育階段表達的基因受生長因子調(diào)節(jié)的基因或者分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達的基因。差示雜交法的局限1）反應(yīng)靈敏性不夠高，不適用于低豐度的mRNA的目的基因。2）需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量噬菌斑，十分費時耗力；3）重復(fù)性差。3.2.2減法雜交基本原理：盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從而有效富集目的基因序列，提高基因篩選分離的敏感性。1）mRNA減法雜交從表達目的基因的組織提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再與無目的基因表達的組織提取的mRNA做過量雜交，兩者均表達的基因產(chǎn)物將形成cDNA/mRNA雜交分子，而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA仍單鏈，將其分離即為差異表達序列。圖用遞減文庫和探針分離T細胞受體基因從T細胞提取RNA假定編碼T細胞受體的基因僅在T細胞中表達而在B細胞中不表達用從T細胞制備的單鏈cDNA與過量的B細胞poly(A)RNA雜交，在這兩種類型細胞中均表達的分子將以cDNA-RNA的形式發(fā)生雜交，那些僅在T細胞中表達的cDNA分子(約占總mRNA的2％)仍以游離的單鏈形式存在。從B細胞制備RNA用羥磷灰石柱分離這種雜交混合物，在一定洗脫條件下，DNA-RNA雜交雙鏈分子結(jié)合在柱上，單鏈cDNA則從柱中流出。回收這些T細胞特異的單鏈cDNA分子并把它們轉(zhuǎn)變成雙鏈，再克隆至λ噬菌體載體中，產(chǎn)生一個約含5000個克隆的遞減文庫。2）基因組DNA減法雜交可以用來分離缺失突變基因。3.2.3mRNA差別顯示技術(shù)mRNAdifferentialdisplaybyRCR,DD-PCR基因的差異表達：在生物個體發(fā)育不同階段，或不同的組織與細胞中或不同環(huán)境下，基因表達差異。即不同基因有序的時空表達方式。差異顯示PCR(DD-PCR)：通過對特定組織類型的總mRNA進行PCR擴增、電泳，并找出待測組織和對照之間的特異擴增條帶。差異顯示PCR(DD-PCR）的引物:3’-端錨定引物，5’-T11MN或5’-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。5’端隨機引物：10個核苷酸長度，20種全部的240組引物，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進行PCR擴增，可以得到20000條DNA帶，基本涵蓋了一定發(fā)育階段某種類型細胞所表達的全部mRMA。DD－PCR切割差異條帶，回收cDNA制備探針在基因文庫中篩選，獲得該差異片段對應(yīng)的全長cDNA或者完整基