大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)研究

大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)研究

山奈酚是一種可從姜科植物山奈根莖、山奈刺的山奈提取物中提取的黃酮醇，以及從姜屬植物的優(yōu)勢(shì)物質(zhì)中提取的原始黃酮醇。它也是銀杏和沙棘等植物有效部位中最重要的黃酮醇之一。藥理研究表明,它可抑制金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌和痢疾桿菌的生長(zhǎng);對(duì)眼醛糖還原酶有抑制作用;能止咳祛痰;利尿。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?考察山奈酚的吸收特性,為山奈酚及其類似物的開發(fā)提供生物藥劑學(xué)信息。1材料和方法1.1儀器、試劑和儀器LaballianceSeriesⅢ型等度系統(tǒng)HPLC儀(美國(guó)SSI公司),包括SeriesⅢ型泵、Model500型UV-Vis檢測(cè)器和7725i進(jìn)樣閥;TU-1800紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);HL-2型恒流蠕動(dòng)泵(上海青浦滬西儀器廠)。山奈酚購(gòu)自上海同田生化科技有限公司,批號(hào):05010802,含量≥99%;苯酚紅、抗壞血酸均購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;戊巴比妥鈉購(gòu)自佛山市化工實(shí)驗(yàn)廠;Krebs-Ringer's營(yíng)養(yǎng)液(簡(jiǎn)稱K-R液)按藥典2005版配制;tween-80購(gòu)自成都長(zhǎng)聯(lián)化工試劑有限公司;乙腈和醋酸均為色譜純,水為三蒸級(jí)純化水,其他試劑均為分析純。Wistar大鼠,雄性,體質(zhì)量170~200g,購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2貯備液的設(shè)計(jì)供試液:取山奈酚10mg,精密稱定,置于100mL容量瓶中,用乙醇稀釋定容,得濃度約為100μg/mL的貯備液。分別精密吸取貯備液適量,用乙醇稀釋定容至10mL,得高、中、低3個(gè)濃度的乙醇藥液。精密吸取藥液1mL于100mL容量瓶,加入增溶劑,用含0.2%抗壞血酸的K-R液稀釋定容,即得。酚紅補(bǔ)液的配制:精密吸取乙醇1mL及與供試液相同比例的增溶劑,用含0.2%抗壞血酸和20μg/mL酚紅的K-R液稀釋定容至100mL。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1回收率、精密度與定量限酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取酚紅8mg,用K-R液溶解并定容至100mL。精密吸取適量,用K-R液連續(xù)稀釋,配制成濃度分別為4、8、16、32、64、80μg/mL的酚紅系列工作液。分別取上述溶液各0.5mL,置7mL塑料離心管中,準(zhǔn)確加入0.2mol/LNaOH5mL,顯色10min,在558nm處測(cè)吸光度(A)值。以吸光度A對(duì)酚紅質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程A=0.0155ρ+0.0067(r=0.9999),高(64μg/mL)、中(16μg/mL)、低(4μg/mL)濃度的平均回收率分別為100.00%、100.00%、91.13%(n=5),日內(nèi)精密度分別為0.43%、0.78%、4.75%(n=5)。酚紅含量的測(cè)定:將大鼠在體腸循環(huán)液不同時(shí)間點(diǎn)的樣品分別用0.45μm微孔濾膜過濾,取0.5mL續(xù)濾液,準(zhǔn)確加入0.2mol/LNaOH溶液5mL,以0.2mol/LNaOH溶液為空白,在558nm處測(cè)定A值。將A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得酚紅質(zhì)量濃度。1.3.2循環(huán)溶液中藥物質(zhì)量濃度的測(cè)定1.3.2.流動(dòng)相、柱溫度shim-packODSC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈-水(40∶60,水相為0.6%的醋酸溶液),流速為1.00mL/min;柱溫為40℃;測(cè)定波長(zhǎng)370nm。1.3.2.樣品的制備和測(cè)定分別取空白循環(huán)液(含0.2%抗壞血酸和20μg/mL酚紅的K-R液,大鼠小腸循環(huán)灌注2.5h即得)、K-R液+山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液在上述色譜條件下進(jìn)樣,由附圖可知,對(duì)照液與樣品溶液中山奈酚出峰時(shí)間一致,約為5.02min,空白循環(huán)液中酚紅和其它成分不干擾測(cè)定。1.3.2.回收率與精密度精密吸取濃度約為100μg/mL的乙醇貯備液1mL,置于100mL容量瓶,加入0.1g/mLtween-801mL,用含0.2%抗壞血酸的K-R液稀釋定容,得濃度為1000ng/mL的溶液,再用含0.001g/mLtween-80、0.2%抗壞血酸的K-R液連續(xù)稀釋,配成濃度約為20、40、100、200、400、800、1000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液,取20μL注入液相色譜儀,以峰面積A對(duì)藥物質(zhì)量濃度ρ(ng/mL)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程A=58.015ρ-105.05(r=0.9999),表明在20.04~1000.18ng/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。高(800.14ng/mL)、中(200.04ng/mL)、低(40.08ng/mL)濃度的平均回收率為(98.96±1.69)%、(100.06±1.62)%、(100.02±3.02)%(n=5),日間精密度為1.71%、1.62%、2.95%(n=5),日內(nèi)精密度為2.07%、1.71%、3.64%。按信噪比(S/N)=3計(jì)算山奈酚最低檢測(cè)限為10.02ng/mL,最低定量限為20.04ng/mL。1.3.2.實(shí)驗(yàn)?zāi)c管處設(shè)置取實(shí)驗(yàn)前禁食12h、體質(zhì)量為200g左右的Wistar大鼠,隨機(jī)分組,每組5只,腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)。麻醉后固定,沿腹中線打開約3cm,在實(shí)驗(yàn)?zāi)c管兩端各切一小口,在上端小口處插入玻璃管并結(jié)扎,用注射器將37℃的生理鹽水緩緩注入腸管,洗去腸管內(nèi)容物至凈。然后在實(shí)驗(yàn)?zāi)c管下端小口處插入玻璃管并結(jié)扎,將玻璃管與蠕動(dòng)泵的膠管相連,形成回路,開動(dòng)蠕動(dòng)泵。先調(diào)節(jié)流速為5mL/min,平衡10min后調(diào)節(jié)流速為2.5mL/min。每隔15min取樣,每次取出1.0mL,并立即補(bǔ)充酚紅補(bǔ)液1.0mL。所取循環(huán)液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液0.5mL進(jìn)行酚紅含量的測(cè)定,20μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行山奈酚含量的測(cè)定。1.4酚吸收速率的測(cè)定對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素幾個(gè)考察水平下得出的山奈酚吸收速率常數(shù)Ka和每小時(shí)吸收百分率P進(jìn)行方差分析(兩兩比較采用q檢驗(yàn))和雙側(cè)t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備以空白循環(huán)液為溶劑,配制高(800ng/mL)、中(150ng/mL)、低(75ng/mL)3個(gè)濃度的山奈酚供試液,置于37℃中水浴,分別于0、2、4、6h取樣,20μL注入高效液相色譜儀,記錄峰面積。以各時(shí)間點(diǎn)下峰面積與零時(shí)刻峰面積的比值來表示藥物剩余百分率,結(jié)果見表1,表明藥物在空白循環(huán)液中至少能穩(wěn)定6h。2.2大鼠對(duì)體腸的吸收2.2.1藥物吸收速率和吸收速率計(jì)算以中濃度(75ng/mL)供試液在小腸全腸段循環(huán),考察結(jié)扎膽管與否對(duì)山奈酚腸吸收的影響。以剩余藥量的對(duì)數(shù)對(duì)取樣時(shí)間作圖,求得藥物吸收速率常數(shù)Ka、吸收半衰期t1/2和每小時(shí)吸收百分率P,結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)分析顯示,結(jié)扎膽管與不結(jié)扎膽管兩組的山奈酚腸吸收參數(shù)值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明在本實(shí)驗(yàn)條件下,結(jié)扎膽管對(duì)山奈酚腸道吸收影響不大。2.2.2山奈酚小鼠吸收參數(shù)的差異分別以高、中、低3個(gè)濃度的供試液在小腸全腸段循環(huán),考察濃度因素對(duì)山奈酚小腸吸收的影響,結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)分析顯示,給予不同濃度的供試液,山奈酚小腸吸收參數(shù)Ka和P值不同(P<0.05),其中高濃度組與中濃度組無差別,高濃度組與低濃度組、中濃度組與低濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即低濃度組>中濃度組≈高濃度組。提示山奈酚在小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)可能存在載體介導(dǎo)。2.2.3山奈酚在各個(gè)腸段的吸收以400ng/mL的供試液考察十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收情況,結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)分析顯示,山奈酚在各個(gè)腸段的吸收有差異(P<0.05),其中十二指腸的Ka和P值大于其余各腸段(P<0.05),而空腸、回腸、結(jié)腸間Ka和P值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示十二指腸可能為山奈酚的最佳吸收部位。2.2.4tween-80對(duì)山奈酚小鼠吸收的影響分別以3個(gè)濃度的tween-80為增溶劑,考察中濃度(150ng/mL)供試液的小腸吸收情況,結(jié)果見表5。數(shù)據(jù)分析顯示,不同濃度的tween-80對(duì)山奈酚的小腸吸收有影響(P<0.05),其中0.01g/mLtween-80組小于0.001g/mL組和0.002g/mL組(P<0.05),而0.001g/mL組與0.002g/mL組間Ka和P值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？烧J(rèn)為1%的tween-80能抑制小腸對(duì)山奈酚的吸收。3tween-80對(duì)山奈酚的吸收作用本實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體腸吸收模型考察了山奈酚吸收特性,為藥物臨床應(yīng)用和制劑的開發(fā)提供了一些信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,膽汁排泄和膽汁分泌在本實(shí)驗(yàn)條件下不影響山奈酚的吸收;十二指腸為山奈酚最佳吸收部位,提示可應(yīng)用制劑學(xué)方法控制山奈酚在十二指腸的滯留時(shí)間,以提高其吸收程度,從而提高其生物利用度;山奈酚吸收速率常數(shù)隨藥物濃度的增加而減小,提示其吸收并非簡(jiǎn)單的被動(dòng)擴(kuò)散,可能有轉(zhuǎn)運(yùn)載體的介導(dǎo),提示臨床用藥時(shí)應(yīng)注意藥物的給藥劑量;增溶劑tween-80濃度對(duì)藥物吸收有影響,0.01g/mL的tween-80能減少腸道對(duì)山奈酚的吸收,提示制劑中選用輔料時(shí)應(yīng)考慮輔料的種類和用量。有文獻(xiàn)報(bào)道1g沙棘黃酮粗品濃縮液(含總黃酮24%左右)酶解后含山奈酚12.49mg,占總苷元的9.95%。而沙棘有效部位醋柳黃酮臨床常用劑量為每次10~20mg(按總黃酮計(jì)),按照人與大鼠劑量換算關(guān)系,本研究最后確立山奈酚腸灌注液的中濃度為150ng/mL。由于檢測(cè)方法定量限的限制,確立低濃度為75ng/mL。山奈酚不溶于水,結(jié)構(gòu)中存在的多個(gè)酚羥基使其很容易被氧化,因此腸灌注液的配制是本課題首先要解決的問題,考慮到山奈酚溶于乙醇,且乙醇的毒性較小,本實(shí)驗(yàn)采用乙醇配制山奈酚貯備液,用tween-80增溶,再用含0.2%抗氧化劑抗壞血酸的K-R液來稀釋定容。Brand等的研究表明口服乙醇后,乙醇通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)破壞脂質(zhì)雙分子層是經(jīng)皮吸收的藥物吸收增加的潛在機(jī)制之一。由于溶解性的限制,無法做陰性對(duì)照來確切的考察乙醇對(duì)吸收的影響程度。為了減少乙醇對(duì)吸收的影響