中藥赤芍中拮抗脂多糖的藥理學(xué)活性檢測(cè)

中藥赤芍中拮抗脂多糖的藥理學(xué)活性檢測(cè)

嚴(yán)重?zé)齻?、傷口和感染可由外源性?xì)菌感染或腸內(nèi)毒素酶波動(dòng)引起，膿毒癥（pi）可能會(huì)加劇。膿毒癥是臨床危機(jī)患者死亡的主要原因，死亡率為56%-60%。目前已證實(shí),革蘭陰性菌內(nèi)毒素(endotoxin),即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起膿毒癥的主要啟動(dòng)子。赤芍為毛茛科芍藥PaeoniaLactiflraPall或川赤芍PaeoniaVeitchiiLynch的干燥根。屬傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥,其味苦,微寒,歸肝經(jīng)。具有清熱涼血,散瘀止痛之功能?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抗凝、抗血栓、抗氧化等廣泛的生物活性,能夠用于心血管、肝臟等多種疾病,最近的研究表明赤芍具有很強(qiáng)的抗LPS作用,我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn),赤芍含有很高的具有與LPS發(fā)生結(jié)合作用的物質(zhì)并從中分離出6個(gè)具有拮抗LPS作用的組分,筆者就是對(duì)這6種赤芍有效組分進(jìn)行體外拮抗LPS的實(shí)驗(yàn)研究,從藥效學(xué)角度深入探討其物質(zhì)基礎(chǔ),進(jìn)而闡明其作用機(jī)制、明確其臨床適應(yīng)證,將具有重要的學(xué)術(shù)及臨床價(jià)值。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞、mtt和tnf-elisa試驗(yàn)LPSO111:B4(美國(guó)Sigma公司),LPS檢測(cè)鱟試劑(廣東湛江安度斯公司),DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司),MTT溶液(美國(guó)Sigma公司),小鼠RAW264.7細(xì)胞(購(gòu)自ATCC),小鼠TNF-αELISA試劑盒(北京晶美公司)。1.1.2elisarap3-el模型EDS-99LPS定量測(cè)定系統(tǒng)(廣東湛江安度斯公司),ELISAReader酶標(biāo)儀(瑞典Biochrom公司),二氧化碳孵箱(美國(guó)Thermo公司),水平離心機(jī)(上?？茖W(xué)儀器廠),低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。1.2方法1.2.1兩組細(xì)菌lps表達(dá)水平將前期分離提取得到的6個(gè)赤芍提取物組分與定量的LPS標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合,配成終濃度為:赤芍各組分為50mg/ml和LPS1EU/ml,PMB組為對(duì)照,劑量為50mg/ml,放入水浴箱,37℃孵育20min后,取100ml混合后的樣本加入到100ml的鱟試劑,按照EDS-99細(xì)菌LPS測(cè)定系統(tǒng)(動(dòng)態(tài)濁度法)操作方法進(jìn)行,測(cè)定中和后的LPS值,結(jié)果以EU/ml報(bào)告,并計(jì)算中和率:LPS中和率=(總LPS實(shí)測(cè)值-中和后LPS實(shí)測(cè)值)/總LPS實(shí)測(cè)值。1.2.2小鼠細(xì)胞中l(wèi)ps表達(dá)的檢測(cè)將來(lái)自ATCC的凍存單核細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d后分瓶傳代,最后離心收集細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)得到0.5×106/ml的細(xì)胞后加入到96孔培養(yǎng)板中,每孔200μl。實(shí)驗(yàn)中分兩組,一組在培養(yǎng)的小鼠RAW264.7細(xì)胞中加入終濃度為80mg/ml的赤芍各組分,并同時(shí)加入終濃度為100ng/ml的LPS,并以已經(jīng)明確抑制LPS的多粘菌素B(PMB,終濃度為80mg/ml)為對(duì)照;另一組在培養(yǎng)的小鼠RAW264.7細(xì)胞中加入赤芍各組分后只加入等體積于LPS的PBS為空白對(duì)照組,在CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后取上清,用ELISA的檢測(cè)試劑盒測(cè)定TNF-α的含量。1.2.3心肌病原代培養(yǎng)rpm為了排除赤芍組分本身的原因造成細(xì)胞死亡而影響細(xì)胞因子的檢出。選擇最有活性的赤芍1組分來(lái)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞活力的影響,將培養(yǎng)3h后的RAW264.7細(xì)胞,加入不同濃度的赤芍1組分:LPS組加入100ng/ml的LPS),繼續(xù)培養(yǎng)2h。將培養(yǎng)板置離心機(jī),1000rpm離心5min,使細(xì)胞全部貼壁,小心吸去上清,PBS輕輕洗滌,再次離心。每孔加入200ml新鮮DMEM培養(yǎng)液,再加入20mlMTT溶液(5mg/ml),37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后,終止培養(yǎng),1000rpm離心10min,小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150ml二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解,在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。1.3統(tǒng)計(jì)分析方法所有的計(jì)量資料均以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS(statisticalpackageforthesocialscience)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,兩組比較采用t檢驗(yàn),多組之間比較采用方差分析。以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異非常顯著。2結(jié)果2.1體外低表面活性劑的凝集反應(yīng)對(duì)內(nèi)毒素的中和作用是抗內(nèi)毒素物質(zhì)抑制內(nèi)毒素生物學(xué)效應(yīng)的主要方式。體外的LPS中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示赤芍1～6組分均能夠抑制LPS催化的鱟試劑凝集反應(yīng)。其中赤芍第1、4、5、6組分效果十分明顯。結(jié)果見(jiàn)表1。2.2抑制tnf-fsh的效果首先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣本的TNF-α結(jié)果,見(jiàn)表2。2.3赤充1組細(xì)胞活力檢測(cè)從以上的結(jié)果可以看出赤芍1組分抑制LPS刺激小鼠單核細(xì)胞釋放TNF-α效果最明顯,因此對(duì)赤芍1組分進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)具有代表性,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示赤芍1組分與空白及LPS組之間幾乎沒(méi)有明顯的差異,說(shuō)明赤芍對(duì)細(xì)胞的活性不產(chǎn)生影響。排除了可能是由于赤芍本身的原因造成細(xì)胞死亡而影響細(xì)胞因子的檢出。3赤充物體作用機(jī)制的研究膿毒癥是機(jī)體在感染后發(fā)生過(guò)度炎癥反應(yīng)所引起的一種復(fù)雜的臨床綜合征,進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能衰竭(multipleorganfailure,MOF)甚至死亡,是目前臨床危重患者的主要死亡原因之一。由LPS引起的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征和膿毒癥在中醫(yī)理論屬于溫病、熱癥等范疇,傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥治療膿毒癥時(shí)主要采用清熱解毒、氣營(yíng)兩清、回陽(yáng)救逆等方法。赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根,屬傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥,具有清熱解毒、涼血化瘀等功能,現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗凝、抗血栓、抗氧化等廣泛的生物活性,能夠用于心血管、肝臟等多種疾病。目前對(duì)赤芍抗LPS作用的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚,因此從藥效學(xué)角度深入探討其物質(zhì)基礎(chǔ),進(jìn)而闡明其作用機(jī)制、明確其臨床適應(yīng)證,將具有重要的學(xué)術(shù)及臨床價(jià)值。我們將不同組分的赤芍提取物與1EU/ml的LPS共同孵育20min后,再用定量鱟試驗(yàn)測(cè)定游離的LPS值,結(jié)果顯示6個(gè)組分的赤芍能夠分別中和LPS的60.3%、32.3%、48.9%、88.4%、67.7%和55.8%。該結(jié)果也提示赤芍6個(gè)組分與LPS的結(jié)合作用具有中和活性,它們與LPS的結(jié)合位點(diǎn)可能就是LipidA。由于LPS分子中負(fù)電荷的數(shù)量、位置與LPS分子的空間構(gòu)象和活性密切相關(guān),只有在負(fù)電荷的相互作用下,構(gòu)象成圓錐形,LPS才具有活性,赤芍有效組分與LipidA所帶負(fù)電基團(tuán)的結(jié)合,可能改變了LPS分子的陰離子特性,從而影響了LPS分子的構(gòu)象,最終影響了它對(duì)鱟試劑的凝結(jié)反應(yīng)。LPS活化單核細(xì)胞后,釋放TNF-α等細(xì)胞因子,介導(dǎo)膿毒癥的發(fā)生。TNF-α被認(rèn)為是在LPS休克病程中最早釋放且起關(guān)鍵作用的介質(zhì)。LPS與巨噬細(xì)胞結(jié)合后,通過(guò)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),激活NF-κB,迅速誘導(dǎo)TNF-αmRNA的合成,導(dǎo)致TNF-α的大量釋放,TNF-α在LPS介導(dǎo)的病理?yè)p害中的主要作用為:誘導(dǎo)一氧化氮的合成;介導(dǎo)血小板活化因子、前列腺素等脂類介質(zhì)以及IL-1、IL-6等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生;誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過(guò)氧化損害。研究表明,TNF-α和LPS的檢出水平與病情及預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)體外培養(yǎng)的小鼠RAW264.7細(xì)胞研究顯示,赤芍6個(gè)組分中1、4、5組分對(duì)TNF-α釋放的抑制作用顯著。進(jìn)一步觀察赤芍1組分對(duì)小鼠培養(yǎng)細(xì)胞的影響(MTT實(shí)驗(yàn))。MTT能定量反映活細(xì)胞的數(shù)量或細(xì)胞活性的變化。LPS的測(cè)定結(jié)果為0.227±0.0294,不同濃度