煙草細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

煙草細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

集體培訓不僅是快速植物育種的一種手段，也是植物改良、物種保存和二次材料生產(chǎn)的一種理想方式。有關(guān)煙草組織和細胞培養(yǎng)已有不少報道,近年來在抗性研究、基因轉(zhuǎn)化和次生物質(zhì)生產(chǎn)等方面也取得一些進展。有研究表明,以植物懸浮培養(yǎng)細胞為材料生產(chǎn)次生代謝物具有培養(yǎng)周期短、材料均一、重復性好等優(yōu)點。煙草中含有大量次生代謝物,因此,建立穩(wěn)定而具有高活力的煙草懸浮培養(yǎng)細胞體系對次生代謝物的生產(chǎn)有重要意義。到目前在白肋煙的愈傷組織培養(yǎng)和細胞懸浮培養(yǎng)方面的研究報道較少。本試驗以白肋煙鄂煙1號的葉為材料進行了愈傷組織的誘導,確定獲得脆散性愈傷組織的最佳激素配比,并以此為基礎(chǔ)建立起煙草細胞懸浮培養(yǎng)體系,旨在為煙草中次生物質(zhì)的生物開發(fā)利用提供依據(jù)。1材料和方法1.1試驗材料鄂煙1號煙草種子,由鄭州煙草研究院提供。1.2測試方法1.2.1種子幼苗的制備將煙草種子用70%酒精浸泡1min,10%NaClO消毒10min,經(jīng)無菌水漂洗后接種于無激素的MS固體培養(yǎng)基,28℃下暗培養(yǎng),之后將未污染的發(fā)芽種子轉(zhuǎn)接到MS0固體培養(yǎng)基上,于28℃下光照培養(yǎng)16h,得無菌種子幼苗。1.2.2加有激素的基本培養(yǎng)基取無菌苗葉片外植體,切成5mm×5mm的小塊,接種在加有激素的3種基本培養(yǎng)基上,各處理見表1。28℃下暗培養(yǎng),15d后得到初始愈傷組織。1.2.3培養(yǎng)葉片的激素配比在基本培養(yǎng)基篩選的基礎(chǔ)上,篩選出最優(yōu)基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,其對激素配比做進一步的調(diào)整細化,見表2,選取長勢較好的愈傷組織繼代培養(yǎng),篩選最佳生長培養(yǎng)基。1.2.4脆散性損傷按已確定的生長培養(yǎng)基配方配制固體生長培養(yǎng)基,選擇長勢較好、黃白色的愈傷組織進行繼代,28℃下暗培養(yǎng),第4代后獲得脆散性愈傷組織。1.2.5愈傷組織的生物干重百分率測定按已確定的最優(yōu)生長培養(yǎng)基配方配制固體培養(yǎng)基,滅菌分裝于三角瓶中。將切好的脆散性愈傷組織稱重后接種于編號的三角瓶中,記錄m1;于28℃下暗培養(yǎng),每2d取樣1次,每次取樣3瓶,稱取愈傷組織鮮重,記錄m2;將愈傷組織烘干至恒重,稱重記錄m3。每次取樣的愈傷組織鮮重與干重倍增值的計算方法:愈傷組織鮮重倍增值F=m2/m1愈傷組織干重倍增值D=m3/(m1·1.5%)式中:1.5%為接種愈傷組織的生物干重百分率。依據(jù)愈傷組織鮮重與干重倍增值的平均值繪制生長曲線。1.2.6犯罪人員的培養(yǎng)按已確定的生長培養(yǎng)基配方配制液體生長培養(yǎng)基,將疏松愈傷組織用玻璃棒碾碎,每瓶加入一定量的愈傷組織,pH值為5.7~5.8,28℃下?lián)u床暗培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速110rpm。2結(jié)果與討論2.1愈傷組織的誘導將煙草外植體接種到基本培養(yǎng)基上,28℃下暗培養(yǎng)15d,觀察外植體生長分化的情況,獲得一系列不同分化程度的煙草愈傷組織,見表3。由表3可見,3種基本培養(yǎng)基中激素組合NAA+6-BA的煙草愈傷組織誘導率優(yōu)于2,4-D+KT,NT基本培養(yǎng)基上煙草愈傷組織的誘導率很低。MS培養(yǎng)基的各種處理誘導出愈傷組織最快,約6~8d;B5基本培養(yǎng)基約為10~12d;在NT基本培養(yǎng)基上的誘導時間較長,約35~40d,而且外植體的死亡率也比MS和B5基本培養(yǎng)基高。因此NT培養(yǎng)基不適合本實驗材料愈傷組織的誘導。在MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基上,加2,4-D激素雖然有抑制芽分化的作用,但是濃度高于1.0mg/L時會使愈傷組織變黑,對細胞生長不利。MS培養(yǎng)基上,MS3(NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,煙草胚性愈傷組織的誘導率較高,沒有褐化,MS4(NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L)次之,MS1(2,4-D3.0mg/L+KT0.2mg/L)褐化嚴重;B5基本培養(yǎng)基上,B53(NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,B54(NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L)次之?？梢?3種培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)基適合本實驗材料外植體的誘導。2.2培養(yǎng)基配方的篩選在基本培養(yǎng)基中選擇煙草細胞脫分化程度高、生長快的培養(yǎng)基配方MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L、MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L和MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/L,以此為基礎(chǔ)對激素配比作進一步的調(diào)整(表2),選擇長勢較好,淡黃色的愈傷組織切成小塊,接種到新鮮的培養(yǎng)基上。28℃下暗培養(yǎng)15d,觀察結(jié)果見表4。由表4可以看出:2,4-D和KT組合中,KT濃度一定時,2,4-D比例越大,愈傷組織褐化有加重的趨勢;2,4-D一定時,KT比例越大,愈傷組織分化程度越高。并且該組合愈傷組織生長較慢,體積較小。NAA和6-BA組合中,愈傷組織褐化不明顯,在一定濃度范圍內(nèi),NAA有利于愈傷組織的生長,可一定程度地抑制愈傷組織分化;在一定的NAA濃度下,6-BA比例增大,愈傷組織分化程度加重。總體來看,培養(yǎng)基配方中以MS26即MS+2,4-D0.1mg/L+NAA1.5mg/L+6-BA0.3mg/L的配比最佳,在該培養(yǎng)基上的愈傷組織生長快、疏松程度較好、脫分化程度較高。該培養(yǎng)基可作為建立細胞懸浮系的生長培養(yǎng)基。這與劉衛(wèi)群報導的MS+2,4-D2mg/L+6-BA0.5mg/L煙草愈傷組織誘導效果最好和MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L、MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L愈傷組織生長最快不一致,可能是由于煙草品種和培養(yǎng)條件的不同所致。2.3培養(yǎng)基間愈傷組織生長以MS+2,4-D0.1mg/L+NAA1.5mg/L+6-BA0.3mg/L配方配制固體培養(yǎng)基,選擇長勢較好、淡黃色的愈傷組織切成小塊接種培養(yǎng),每2d取樣1次,稱鮮重和干重。以愈傷組織鮮重、干重生長倍增值的平均值為縱坐標,取樣時間為橫坐標繪圖(圖1)。由圖1可見,在MS24(MS+2,4-D0.1mg/L+NAA1.5mg/L+6-BA0.3mg/L)培養(yǎng)基上愈傷組織生長快,第6d起開始快速生長,14d時鮮重增至接種時鮮重的13.269倍,干重增重12.536倍,達到最高,16d時有所下降,需要更換培養(yǎng)基再次繼代。該培養(yǎng)基可作為建立細胞懸浮系的生長培養(yǎng)基。2.4懸浮系的生長按已確定的最優(yōu)配方即MS+2,4-D0.1mg/L+NAA1.5mg/L+6-BA0.3mg/L制備液體生長培養(yǎng)基,在接種量10%、蔗糖濃度3%、水解酪蛋白濃度0.1%、pH5.8、搖床轉(zhuǎn)速110rpm、28℃下暗培養(yǎng),培養(yǎng)瓶中的懸浮系能夠迅速生長。每15d繼代1次,每次繼代時,將培養(yǎng)瓶靜置幾分鐘后,倒掉2/3原培養(yǎng)液,然后更換新培養(yǎng)瓶,加入新的培養(yǎng)液。連續(xù)繼代4代后,愈傷組織建立的細胞懸浮系生長迅速,顏色淡黃、分散性和均一性均較好,且能夠較長期保存,可作為次生代謝物生產(chǎn)的培養(yǎng)體系。3-ba工藝參數(shù)對愈傷組織生長的影響白肋煙鄂煙1號愈傷組織誘導的3種基本培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基優(yōu)于B5培養(yǎng)基,而NT培養(yǎng)基不適合鄂煙1號愈傷組織的誘導。