鐵皮石斛的生物學(xué)保護(hù)與利用

鐵皮石斛的生物學(xué)保護(hù)與利用

又名黑果草，是一種又名紅景天的多年生草本植物，通常生長(zhǎng)在茂密的森林樹干和巖石上。這是中國古文獻(xiàn)中最早記載的蘭科植物之一。這是2010年版《中華人民共和國藥典》收錄的珍貴中藥品種?，F(xiàn)代藥理研究證明鐵皮石斛具有滋陰清熱、益胃生津、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等作用,被列為“九大仙草”之首,在食用、醫(yī)用及保健領(lǐng)域均有著廣泛的應(yīng)用前景［1－3］。鐵皮石斛藥材來源主要依賴于野生資源,但是鐵皮石斛種子極為細(xì)小,胚胎發(fā)育不完全,無胚乳組織,在自然狀態(tài)下發(fā)芽率極低,有性繁殖困難［4］。長(zhǎng)期的過量采集,導(dǎo)致野生資源急劇下降,難以滿足市場(chǎng)需求。近年來,科研人員努力探索,利用生物技術(shù)方法在鐵皮石斛人工快繁和種質(zhì)改良等方面取得了顯著進(jìn)展。本文對(duì)近年來有關(guān)鐵皮石斛生物技術(shù)方面的研究情況作一綜述,以期為鐵皮石斛資源保護(hù)和創(chuàng)新研究提供參考。1物種資源的分離和鑒定1.1鐵皮石斛種子制作和保存技術(shù)研究鐵皮石斛野生資源稀缺,對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格,因此種質(zhì)資源保存是鐵皮石斛研究中的一個(gè)重要課題。利用組織培養(yǎng)進(jìn)行離體保存是一種有效途徑,但是組織培養(yǎng)長(zhǎng)期繼代會(huì)導(dǎo)致種性退化。鐵皮石斛人工種子可以用于種質(zhì)保存。郭順星等［5］和Saiprasad等［6］先后以海藻酸鈉凝膠為包埋系統(tǒng),制作鐵皮石斛人工種子并進(jìn)行發(fā)芽研究,制定出鐵皮石斛人工種子制作流程。應(yīng)用粘土、蛭石粉等作為固形包埋基質(zhì),制作的人工種子同樣能成功萌發(fā)成苗［7］。張桂芳等［8］研究鐵皮石斛人工種子制作方法和影響因素,發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉用量、BA與NAA質(zhì)量濃度比例、離子交換時(shí)間、活性炭用量等4個(gè)因素對(duì)人工種子萌發(fā)和成苗均有影響,其人工種子萌發(fā)率和成苗率最高分別可以達(dá)到55.5%和39.0%。鐵皮石斛種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存一般采用液氮超低溫保存方法。王君暉等［9］采用快速和慢速脫水干凍法分別對(duì)鐵皮石斛種子、類原球莖體進(jìn)行液氮超低溫保存。陳勇等［10］對(duì)玻璃化法超低溫保存鐵皮石斛原生質(zhì)體和初生原球莖進(jìn)行研究,其存活率分別達(dá)48%和88%。低溫離體保存也是有效方法,史永忠等［11］的研究表明,鐵皮石斛試管苗在4℃黑暗條件下可連續(xù)保存12個(gè)月,并能恢復(fù)正常生長(zhǎng),1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基上的存活率高于MS培養(yǎng)基。添加低濃度活性炭可明顯改善保存材料的狀態(tài)。1.2多樣性分析和聚類分析鐵皮石斛苗期與石斛屬有些品種在形態(tài)特征上有相似性,特別是涉及到種內(nèi)遺傳差異時(shí),利用傳統(tǒng)的鑒別方法往往不易區(qū)分。RAPD［12］、AFLP［13－14］、SSR［15］、ISSR［16－17］等分子標(biāo)記技術(shù)目前被廣泛用于鐵皮石斛不同野生居群、不同栽培群體的遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究。采用RAPD技術(shù)進(jìn)行基因組DNA多態(tài)性分析,能從石斛屬內(nèi)26個(gè)種當(dāng)中方便快捷地鑒別出鐵皮石斛［12］。Ding等［18］利用SRAP標(biāo)記分析鐵皮石斛9個(gè)居群共84份材料的遺傳多樣性,并進(jìn)行聚類分析,結(jié)果表明原位保存是保證鐵皮石斛遺傳多樣性的首選方法;采用RAPD和ISSR分析9個(gè)鐵皮石斛自然居群,表明居群間的遺傳差異明顯,具有豐富的遺傳多樣性,并且ISSR的多樣性檢測(cè)優(yōu)于RAPD［19］。謝明璐等［15］利用開發(fā)的SSR標(biāo)記成功對(duì)鐵皮石斛種質(zhì)純度進(jìn)行鑒定。金波等［20］將擴(kuò)增獲得的鐵皮石斛特異RAPD分子標(biāo)記片段,經(jīng)克隆、測(cè)序,重新設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記,能特異性地在鐵皮石斛中擴(kuò)增出300bp的片段,實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛的快速有效鑒定。Hou等［21］利用15個(gè)新的三核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記能夠簡(jiǎn)便快捷地對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行遺傳多樣性鑒定和分析。建立DNA指紋圖譜,有利于鑒定和篩選鐵皮石斛優(yōu)良品種。虞泓等［22］用AFLP技術(shù)對(duì)石斛屬內(nèi)4個(gè)品種和1個(gè)外類群種進(jìn)行基因組DNA多態(tài)性分析,構(gòu)建了藥用石斛的DNA分子指紋圖譜。為更準(zhǔn)確地進(jìn)行鐵皮石斛種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和遺傳多樣性的分析,趙瑞強(qiáng)等［23］采用正交設(shè)計(jì)和單因素相結(jié)合的方法構(gòu)建和優(yōu)化鐵皮石斛SCoT-PCR反應(yīng)體系,在32份鐵皮石斛材料的遺傳多樣性驗(yàn)證中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性?；蛐酒瑥倪z傳的角度鑒別鐵皮石斛品種真?zhèn)?進(jìn)一步推動(dòng)了鐵皮石斛的遺傳分析和鑒別。Sze等［24］利用5SrDNA的基因間隔區(qū)的不同,建立了高通量鑒定商業(yè)石斛(楓斗石斛)的基因芯片,可以對(duì)鐵皮石斛與其他種類的石斛進(jìn)行有效區(qū)分?；蛐酒c中藥化學(xué)成分指紋圖譜等的鑒定相結(jié)合,能確定鐵皮石斛藥用價(jià)值的優(yōu)劣,發(fā)揮最佳作用［25］。2鐵皮石斛人工快繁技術(shù)鐵皮石斛種子自然狀態(tài)下萌發(fā)率極低,利用組織培養(yǎng)進(jìn)行鐵皮石斛人工快繁是解決鐵皮石斛野生資源短缺的有效途徑,已有大量石斛組織培養(yǎng)條件的研究報(bào)道,目前鐵皮石斛試管苗已進(jìn)入商品化生產(chǎn)。2.1為重組植株的球莖誘導(dǎo)鐵皮石斛組織培養(yǎng)外植體來源廣泛,一般采用野生鐵皮石斛種子［26－29］、根尖［30－31］、莖段［32－34］、腋芽［35］等作為外植體。應(yīng)用最早和最廣泛的外植體是無菌種子,在離體培養(yǎng)條件下,種子萌發(fā)后形成原球莖,原球莖可以直接發(fā)育形成幼苗,也可以誘導(dǎo)原球莖產(chǎn)生大量愈傷組織,由愈傷組織再分化發(fā)育成幼苗［36－37］。唐桂香等［26］以成熟的鐵皮石斛種子為材料,以1/2MS為基本培養(yǎng)基并添加20%馬鈴薯液,種胚萌發(fā)率達(dá)到79.35%,并能成功誘導(dǎo)出原球莖。杜剛等［27］以鐵皮石斛種子為外植體,通過組織培養(yǎng)獲得大量種苗。秦廷豪等［31］用鐵皮石斛莖段、帶頂芽的莖段和根蔸3類外植體在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)僅根蔸能誘導(dǎo)出原球莖。王麗萍等［32］和李澤生等［34］分別以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基,選用鐵皮石斛幼嫩莖段為外植體能夠高效誘導(dǎo)出原球莖。張紅梅等［33］以鐵皮石斛莖段為外植體材料,經(jīng)歷芽誘導(dǎo)、叢生芽增殖和生根培養(yǎng)3個(gè)階段,獲得大量的試管苗,芽誘導(dǎo)率達(dá)到86.7%。2.2培養(yǎng)材料的確定選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)最關(guān)鍵的一步,針對(duì)培養(yǎng)目的、培養(yǎng)途徑、培養(yǎng)階段的不同,所使用的培養(yǎng)基也不同。鐵皮石斛組織培養(yǎng)采用的基本培養(yǎng)基包括MS,1/2MS,N6以及相應(yīng)的改良培養(yǎng)基等［37］。最適培養(yǎng)基的選擇主要根據(jù)不同外植體來源和不同生長(zhǎng)階段決定。以鐵皮石斛種胚作為培養(yǎng)材料,研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)改良的N6培養(yǎng)基對(duì)胚的萌發(fā)和生長(zhǎng)最好,以莖尖作為培養(yǎng)材料,N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織能力明顯不如MS［38－39］。以鐵皮石斛莖段為材料誘導(dǎo)叢生芽,1/2MS誘導(dǎo)的效果最好,生成的苗粗壯［40］。鮑騰飛等［41］的研究表明1/2MS最有利于鐵皮石斛類原球莖的生長(zhǎng)增殖。王春等［42］以1/2MS+1.0mg·L－1BA+0.5mg·L－1NAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖,誘導(dǎo)率達(dá)到58%。鐵皮石斛不同生長(zhǎng)階段的最適培養(yǎng)基也有較大差異。1/2MS、MS和Kc等培養(yǎng)基都適合原球莖的增殖,而B5和1/2MS較適宜鐵皮石斛的壯苗培養(yǎng)［43］。2.3發(fā)酵底物對(duì)鐵皮石斛原球莖的影響除基本培養(yǎng)基之外,包括外源激素、附加物、蔗糖、pH值、溫度和光照等培養(yǎng)條件對(duì)不同階段鐵皮石斛生長(zhǎng)分化均有影響。鐵皮石斛組織培養(yǎng)中常使用的外源激素主要是生長(zhǎng)素類(如IAA、IBA、NAA)和細(xì)胞分裂素類(如BA、ZT和KT)［44］。蘇鈦等［45］的研究表明,BA相對(duì)于其他激素對(duì)鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)效果最好,以2.0mg·L－1BA誘導(dǎo)率最高。洪森榮等［46］探討6-BA和2,4-D對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),添加1mg·L－16-BA和0.1mg·L－12,4-D對(duì)原球莖增殖效果較好。唐桂香等［26］的研究表明,0.5mg·L－1NAA對(duì)鐵皮石斛的生根效果最好。李璐等［47］比較了6-BA和TDZ對(duì)鐵皮石斛花芽誘導(dǎo)的影響,結(jié)果表明,0.2mg·L－1TDZ最適宜誘導(dǎo)其開花。宋順等［48］以MS為基本培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)添加0.5mg·L－16-BA和1.5mg·L－1NAA最適合鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo),其誘導(dǎo)率為95%;而添加1mg·L－16-BA和1mg·L－1NAA最適合原球莖增殖;添加5mg·L－16-BA+1mg·L－1NAA最適合原球莖分化,其分化率達(dá)80%;而在根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中添加1.5mg·L－1IBA+100g·L－1香蕉泥,其生根率能達(dá)到100%。一些有機(jī)添加物對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)、芽增殖、組培苗壯苗具有一定的促進(jìn)作用,已報(bào)道的有馬鈴薯泥［49－50］、香蕉泥［49］、蘋果汁［51］等,使用濃度一般在10%~20%。培養(yǎng)基的pH值、溫度、光照強(qiáng)度和時(shí)間均對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)有明顯的影響。陳青青等［52］研究表明,pH對(duì)鐵皮石斛的苗鮮重和生根率影響顯著,以pH值5.4為宜,其原因可能是pH影響細(xì)胞的透性、代謝和培養(yǎng)物的生長(zhǎng)與分化,在25℃、光照強(qiáng)度為1500lx時(shí),最適宜鐵皮石斛生長(zhǎng)。鮑順淑等［53］的研究表明,在人工光型密閉式植物工廠的可控環(huán)境條件下,在光照強(qiáng)度和CO2濃度一定時(shí),光照時(shí)間控制在12h/d,鐵皮石斛組培苗的凈光合速率和葉綠素含量較高,干重和腋芽數(shù)增加較多,表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)與繁殖能力。3鐵皮石斛的誘導(dǎo)誘導(dǎo)鐵皮石斛生長(zhǎng)相對(duì)緩慢,一般2~3年才能采收,對(duì)現(xiàn)有品種進(jìn)行遺傳改良,培育生長(zhǎng)迅速、藥用有效成分含量高的新品種是提高產(chǎn)量及質(zhì)量的有效途徑。誘變育種突變頻率高,誘發(fā)變異較易穩(wěn)定,可有效改良作物性狀,縮短育種年限［54］。物理及化學(xué)誘變是常采用的方法,輻射誘變結(jié)合組織培養(yǎng),能加速變異性狀的穩(wěn)定和新品種的育成。詹忠根等［55］利用137Csγ射線輻照鐵皮石斛種胚原球莖,針對(duì)形態(tài)變異的試管苗,采用流式細(xì)胞分析DNA的倍性變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分外部形態(tài)發(fā)生改變的植株其細(xì)胞內(nèi)DNA的倍性發(fā)生了改變。洪薩麗等［56］利用60Co-γ輻照霍山石斛原球莖,研究誘變對(duì)石斛生長(zhǎng)和生物堿積累的影響,結(jié)果表明適當(dāng)劑量的60Co-γ輻照處理可促進(jìn)POD、SOD、CAT和PAL酶活性,抑制PPO酶活性,從而能促進(jìn)石斛原球莖生長(zhǎng),提高懸浮培養(yǎng)原球莖生物堿含量。張青華等［57］采用0.09%秋水仙堿處理24h誘導(dǎo)鐵皮石斛叢生芽變異率達(dá)到48%,對(duì)葉、氣孔、染色體的檢測(cè),證明變異芽為四倍體或嵌合體。2.5g·L－1植酸能促進(jìn)石斛多糖的合成,還能促進(jìn)石斛對(duì)碳、氮、磷的吸收［58］。太空誘變育種在中藥材品種培育和改良中應(yīng)用廣泛,目前已有數(shù)十個(gè)審(認(rèn))定的中藥材品種是通過太空誘變獲得的。經(jīng)航天誘變的仙斛1號(hào)鐵皮石斛已經(jīng)通過浙江省非主要農(nóng)作物品種審定委員會(huì)認(rèn)定。太空誘變技術(shù)在有效創(chuàng)造特異突變基因資源和培育作物新品種方面已經(jīng)顯示出重要的作用,成為空間生命科學(xué)研究的重要組成部分［59］。利用太空誘變培育突破性優(yōu)良品種方面具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),使今后獲得更多優(yōu)良鐵皮石斛新品種成為可能。4防腐蝕4.1發(fā)酵活性基因doa鐵皮石斛的藥用有效成分為生物堿、石斛多糖等植物次生代謝產(chǎn)物,這些次生代謝產(chǎn)物需要經(jīng)過復(fù)雜的代謝途徑最終合成,并受代謝的關(guān)鍵酶與限速酶調(diào)控,如轉(zhuǎn)移酶、合成酶、環(huán)化酶等。對(duì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行克隆和分析,是研究鐵皮石斛藥用有效成分代謝途徑及相關(guān)分子機(jī)制的重點(diǎn),也是培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛新品種的基礎(chǔ)。樊洪泓［60］克隆了石斛生物堿合成途徑中的關(guān)鍵基因法呢基焦磷酸合酶基因(FPS)的片段,并進(jìn)行序列分析。為研究鐵皮石斛多糖合成與蔗糖合成酶活性關(guān)系及表達(dá)調(diào)控,孟衡玲等［61］成功克隆了鐵皮石斛蔗糖合成酶基因(DOSS1)并對(duì)其表達(dá)分析。曾淑華等［62］對(duì)克隆的鐵皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc)進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),pepc基因在F型鐵皮石斛中的表達(dá)量為H型的5.55倍。植物凝集素如甘露糖結(jié)合凝集素與植物抗病蟲害密切相關(guān)。鐵皮石斛在自然條件下很少發(fā)生病蟲害,為探究其病蟲害抗性與蘭科植物凝集素之間的內(nèi)在關(guān)系,Chen等［63］提取鐵皮石斛葉片的RNA,根據(jù)蘭科植物凝集素保守序列區(qū)設(shè)計(jì)引物,通過RACE技術(shù)克隆得到全長(zhǎng)768bp的鐵皮石斛甘露糖結(jié)合凝集素基因(DOA),包含1個(gè)498bp的開放閱讀框,其編碼的165個(gè)氨基酸為凝集素前體。半定量RT-PCR分析表明,DOA基因是一個(gè)組成型表達(dá)基因,在根、莖、葉中均有表達(dá),在莖中表達(dá)量最高,可能與鐵皮石斛莖的病蟲害抗性密切相關(guān)。鐵皮石斛自然狀態(tài)下種子萌發(fā)需要真菌共生,生長(zhǎng)階段也常伴有共生真菌。鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinases,CDPKs)以及促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)及其級(jí)聯(lián)途徑在從枝菌根、根瘤菌-宿主植物共生體系中起重要調(diào)控作用。張崗等［64－65］從小菇真菌(Mycenasp.)侵染的鐵皮石斛根中分別克隆了一個(gè)受菌根真菌誘導(dǎo)的鐵皮石斛鈣依賴蛋白激酶基因(DoCPK1)和促分裂原活化蛋白激酶基因(DoMPK1),在小菇真菌侵染30d的石斛根中,DoCPK1和DoMPK1基因表達(dá)均顯著上調(diào),分別達(dá)到對(duì)照根中的5.16倍和7.91倍,表明DoCPK1和DoMPK1基因參與小菇真菌和鐵皮石斛菌根早期互作,可能在該共生體系中起作用。4.2基因刑法檢測(cè)石斛原球莖和國工酶基因的表達(dá)目前,鐵皮石斛的遺傳轉(zhuǎn)化最常用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化關(guān)鍵時(shí)期為共培養(yǎng)階段。Yu等［66］構(gòu)建了含β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表達(dá)載體,以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Hpt)篩選標(biāo)記,將類原球莖與農(nóng)桿菌在無抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d,光照16h·d－1,再轉(zhuǎn)移至添加50mg·L－1羧芐青霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3~4周,之后在含200mg·L－1卡拉霉素的培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)6~8周得到轉(zhuǎn)基因植株。GUS組織化學(xué)檢測(cè)和Southern雜交證明GUS基因成功表達(dá)。基因槍法在石斛轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用更多。Kuchnle等［67］采用微粒轟擊法將Nos-NPTII基因和番木瓜病毒(PRV)外殼蛋白基因(CP)一起導(dǎo)入雜種石斛的原球莖。經(jīng)過卡那霉素選擇培養(yǎng),PCR分析表明,13株抗性植株帶有NosNPT基因,其中有1株帶有PRVCP基因。Chia等［68］成功將熒光素酶基因(Luc)通過基因槍法導(dǎo)入石斛類原球莖并獲得再生植株。Yu等［66］進(jìn)一步發(fā)展了一個(gè)高頻再生、高效而穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化體系。以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因HPT為篩選標(biāo)記,50mg·L－1濃