慢性鼻竇炎模型的改進(jìn)

慢性鼻竇炎模型的改進(jìn)

慢性胃炎通常是一種常見的疾病之一。然而，我們可以直接從人體研究慢性胃炎，尤其是各種治療干預(yù)措施對慢性胃炎后鼻粘膜毛的形態(tài)和功能的回歸的影響，這受到許多因素的限制。因此，自20世紀(jì)20年代以來，許多科學(xué)家使用動物模型研究慢性胃炎，并發(fā)展了各種慢性炎癥模型的建模方法。但是,目前的幾種主要建模方法,仍然存在不少尚待改進(jìn)之處。本實驗在比較幾種傳統(tǒng)建模方法的基礎(chǔ)上,采用上頜竇口不完全堵塞+竇腔留置棉絮的改良建模方法,成功地建立了更接近人類慢性鼻竇炎病因及病理學(xué)特征的兔慢性鼻竇炎模型,為今后研究各種治療干預(yù)手段,特別是評價功能性鼻內(nèi)鏡鼻竇手術(shù)(functionalendoscopicsinussurgery,FESS)后鼻黏膜纖毛形態(tài)與功能轉(zhuǎn)歸的影響提供了更為理想的慢性鼻竇炎的動物模型。材料和方法一、不同給藥大鼠竇口堵塞、注射細(xì)菌體重1.5～3.0kg健康新西蘭大白兔66只,雄雌不限。隨機(jī)分成7組:即單純細(xì)菌組(A組)、單純竇口堵塞組(B組)、竇口堵塞+金黃色葡萄球菌組(C組)、竇口不完全堵塞+竇腔留置棉絮組(D組)、假手術(shù)Ⅰ、Ⅱ組(做同樣的手術(shù)步驟,但不處理竇口及注射細(xì)菌,分別簡稱E、F組)和空白對照組(G組)。其中A～F組每組10只大白兔,G組6只大白兔。整個實驗過程中,動物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食。二、細(xì)菌鑒定儀器顯微手術(shù)器械、LS-A型額燈、VITEK-60全自動細(xì)菌鑒定儀(美國梅里埃公司)、S-520/ISIS300掃描電鏡(日本日立公司)和XSZ-4顯微電鉆(上海光電儀器公司)等。三、細(xì)菌分離和鑒定取門診慢性鼻竇炎患者上頜竇穿刺沖洗液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),用VITEK-60全自動細(xì)菌鑒定儀分離篩選出單一菌株金黃色葡萄球菌,接種于血平板上,置于培養(yǎng)箱中24h,從血平板收集菌落,用生理鹽水稀釋成1麥?zhǔn)蠁挝坏膽覞嵋簜溆?。四、骨膜、皮膚活檢活檢整個過程必須無菌操作。將兔鼻背正中的毛剪短、刮光。氯氨酮50mg/kg肌肉注射麻醉,常規(guī)消毒、鋪巾,1%利多卡因術(shù)區(qū)浸潤麻醉,沿鼻背正中線切一縱長切口,隨機(jī)選取一側(cè)上頜竇前壁,分離皮下組織及骨膜。后續(xù)的實驗操作方法如下:①A、B、C、F組用顯微電鉆在上頜竇前壁鉆開一直徑大約4mm的孔。用生理鹽水沖洗竇腔,然后再將沖洗液提取作細(xì)菌培養(yǎng)。取少量棉絮通過上頜竇前壁所鉆的小孔,嚴(yán)密堵塞竇口。判斷竇口是否完全堵塞可從縫合后瘺口處皮膚判斷,不完全堵塞者皮膚會隨呼吸運動輕微起伏,完全堵塞者皮膚不會隨呼吸運動起伏,而假手術(shù)組皮膚則大幅度起伏。用碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)面。將骨膜、皮膚逐層縫合。②D、E組:用顯微電鉆在上頜竇前壁鉆開一直徑大約1.5mm的孔。用生理鹽水沖洗竇腔,然后再將沖洗液提取作細(xì)菌培養(yǎng)。取少量棉絮通過上頜竇前壁所鉆的小孔,將其置放在竇口及竇腔里,不必完全堵塞竇口。將骨膜、皮膚逐層縫合。③術(shù)后第2天,A、C組用1ml注射器抽取1ml細(xì)菌懸濁液小心通過小孔注入竇腔內(nèi)。④各組于42d后在上述麻醉下再次打開術(shù)側(cè)上頜竇腔,取竇腔分泌物作細(xì)菌分離培養(yǎng),為了避免血液污染標(biāo)本,動物全部切開頸動脈放血處死,完整取出上頜竇黏膜,分別制作常規(guī)光鏡HE染色切片(每份標(biāo)本2張切片,共132張)及黏膜掃描電鏡標(biāo)本,在光鏡及掃描電鏡下觀察(每個視野隨機(jī)觀察5個視野,取平均值)。五、統(tǒng)計處理利用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件包,對檢測數(shù)據(jù)采用卡方檢驗作統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果一、鼻竇其他桿菌感染鼻竇內(nèi)的菌落建模前所有大白兔的上頜竇細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性,建模后上頜竇細(xì)菌培養(yǎng)除金黃色葡萄球菌外,在感染鼻竇內(nèi)還有其他3種桿菌,分別是多殺巴斯德菌、流感桿菌、大腸桿菌,均為單一細(xì)菌(未行厭氧菌檢查)。具體結(jié)果見表1。二、竇竇腔感染不同從術(shù)后第3～5天起,B組60%(6只)、C組100%(10只)先后術(shù)側(cè)上頜竇前壁隆起,紅腫,結(jié)膜充血、水腫,溢淚,噴嚏,膿涕,膿腫先后潰爛、溢出白色黏稠膿液,骨質(zhì)增生,骨贅形成,整個上頜竇竇腔原有結(jié)構(gòu)被破壞,竇內(nèi)積膿。第5天起D組100%(10只)先后出現(xiàn)膿涕、噴嚏、結(jié)膜水腫充血癥狀,但未出現(xiàn)竇內(nèi)積膿,原有竇腔結(jié)構(gòu)基本存在。術(shù)后第12天B組2只兔也出現(xiàn)膿涕、噴嚏癥狀,但未出現(xiàn)膿腫,原有竇腔結(jié)構(gòu)基本存在。B、C、D組感染竇腔中均有多量白色黏稠膿液。A、E、F、G組中未感染兔均未見異常表現(xiàn)。三、中重度炎癥表現(xiàn)光鏡下A、E、F、G組新西蘭大白兔上頜竇黏膜由假復(fù)層纖毛上皮構(gòu)成,排列整齊,少量腺體散在分布,偶見杯狀細(xì)胞(圖1)。B、C、D組術(shù)側(cè)所有感染上頜竇者均呈中重度炎癥表現(xiàn)(圖2,3),黏膜上皮增生,纖毛紊亂,并有部分壞死、出血、小潰瘍形成,可見大量杯狀細(xì)胞,黏膜下纖維組織、腺體重度增生,大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤,骨質(zhì)增生。根據(jù)在光鏡下觀察到的病理現(xiàn)象,參考Forsgren等所采用的方法,劃分成半量化等級病理結(jié)果(-、+、++,表2)。四、胞與大量的釋放型細(xì)胞A、E、F、G組黏膜纖毛均勻、密集、方向一致,纖毛細(xì)胞與少量的分泌型細(xì)胞混合存在(圖4);B、C、D各組感染鼻竇黏膜纖毛稀疏、倒伏、脫落、紊亂,上皮細(xì)胞裸露,分泌細(xì)胞增生,突出黏膜表面,細(xì)胞間失去正常結(jié)構(gòu)(圖5)。討論一、d組建模方法優(yōu)缺點理想的慢性鼻竇炎動物模型應(yīng)滿足下列要求:①建模過程沒有直接損害竇腔;②與人類慢性鼻竇炎的病因及病理生理相符合;③模型復(fù)制出來的鼻竇炎具有向其他鼻竇侵犯的能力;④在病理學(xué)上具有炎癥分期分級的征象;⑤方法簡便,建模成功率高。目前,文獻(xiàn)報道的較常用的建模方法有:①直接向竇腔注入細(xì)菌,不堵塞竇口;②單純堵塞竇口,不接種細(xì)菌;③堵塞竇口,同時向竇腔接種細(xì)菌;④上頜竇內(nèi)留置異物。目前,多用第3種方法。上述傳統(tǒng)建模方法在打開上頜竇腔時所造成的上頜竇損傷較大,有的甚至將上頜竇整個前壁去除,這樣破壞了鼻竇腔的完整性,導(dǎo)致不必要的炎癥反應(yīng),并且破壞了毛細(xì)血管系統(tǒng)和鼻黏膜纖毛輸送系統(tǒng)。此外,第1種方法由于竇口引流通暢,細(xì)菌很快從竇口流出,停留時間過短,不易成功。第3種方法所構(gòu)建的動物模型幾乎是壞死性感染,更接近膿腫,缺乏炎癥的分期表現(xiàn),許多微小但重要的病理變化被迅速劇烈的感染所掩蓋。同時竇腔炎癥從尚未愈合的瘺口擴(kuò)散,造成嚴(yán)重的骨髓炎和上頜竇前壁膿腫,上頜竇的結(jié)構(gòu)基本上被完全破壞,影響后續(xù)的實驗。針對傳統(tǒng)建模方法存在的缺點,本實驗D組方法作了如下改進(jìn):上頜竇前壁只鉆直徑1.5mm的小孔,經(jīng)小孔留置棉絮于上頜竇口上,造成上頜竇口不完全堵塞。這種改進(jìn)的優(yōu)點有:①更符合人類慢性鼻竇炎的病因?qū)W基礎(chǔ)。慢性鼻竇炎并不是竇口的完全堵塞所致,鼻竇竇口的完全堵塞,通常導(dǎo)致鼻竇的黏液囊腫或霉菌病。因此,D組建模方法在基本保留了鼻竇原有結(jié)構(gòu)的前提下,采取棉絮不完全堵塞竇口,造成竇口通氣障礙,引流不暢,竇內(nèi)PO2下降,PCO2上升,纖毛活性下降;留置在竇腔的棉絮充分接觸黏膜,造成纖毛運動紊亂或停止及纖毛反向運動,纖毛傳輸功能下降,繼而細(xì)菌繁殖引起鼻竇感染。②上頜竇前壁只須鉆1.5mm左右小孔,這種“微創(chuàng)”的建模方法比其他建模方法對鼻竇結(jié)構(gòu)及生理功能的干擾明顯減小,對后續(xù)的實驗所造成的影響甚小。③方法簡單,建模成功率達(dá)100%。由于無須嚴(yán)密堵塞竇口,建模操作過程所需時間極短,從麻醉到縫合,熟練者只需15min左右即可完成一個建模操作過程。④所建立的模型更適合有關(guān)FESS的研究。Forsgren等研究各種手術(shù)對兔實驗性鼻竇炎模型病理改變的作用,認(rèn)為嚴(yán)重鼻竇鼻腔疾病不適合行FESS。在本模型中,由于保存了竇口的部分引流功能,并不會造成過于劇烈的炎癥反應(yīng)及炎癥向竇周圍擴(kuò)散而引起其他嚴(yán)重的并發(fā)癥,更適合有關(guān)FESS的研究。因此,我們認(rèn)為,采用竇口不完全堵塞+竇腔留置棉絮的方法可穩(wěn)定高效、方便快捷地建立慢性鼻竇炎模型,比目前文獻(xiàn)報道的建模方法優(yōu)越。從表2也可以看到,D組所誘導(dǎo)的慢性鼻竇炎與B、C組慢性鼻竇炎相比,其病理特征更符合人類慢性鼻竇炎的特征。二、多殺巴斯德菌的臨床研究臨床上,急慢性上頜竇炎是由需氧菌和厭氧菌在內(nèi)的多種細(xì)菌的混合感染所致,金黃色