植物內(nèi)生細(xì)菌的基因工程防治

植物內(nèi)生細(xì)菌的基因工程防治

植物內(nèi)部環(huán)境是一種微生物，可以在一生或一生的特定階段進(jìn)入植物組織，并不會(huì)導(dǎo)致植物明顯變化。內(nèi)生細(xì)菌普遍存在于植物體內(nèi),與寄主植物在長期進(jìn)化過程中建立了和諧聯(lián)合關(guān)系,是植物微生態(tài)系統(tǒng)中巨大而寶貴的資源庫。自20世紀(jì)90年代起,植物內(nèi)生細(xì)菌的研究已成為微生物學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。首先,內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的種群多樣性,對寄主植物具有內(nèi)生固氮、促生、抗病蟲害、殺線蟲等多種作用[5,6,7,8,9,10,11,12];其次,內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)占據(jù)穩(wěn)定的生存空間,不易受植物外環(huán)境的影響,在植物體內(nèi)獨(dú)立地繁殖和傳遞,并與植物病原菌競爭相似的生態(tài)位,是具有生防潛力的微生物菌群;此外,國外已有許多報(bào)道稱內(nèi)生細(xì)菌能夠降解環(huán)境中的污染物,具有生物修復(fù)能力;同時(shí)內(nèi)生細(xì)菌可作為潛在的生防載體菌加以利用。植物內(nèi)生細(xì)菌種類多、繁殖快、代謝產(chǎn)物豐富、易于培養(yǎng),在化學(xué)農(nóng)藥引起的一系列環(huán)境污染的當(dāng)下,植物內(nèi)生細(xì)菌顯然具有重要的應(yīng)用前景。筆者就植物內(nèi)生細(xì)菌的國內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)及其在農(nóng)林業(yè)病蟲害生物防治上的應(yīng)用潛力以及存在的問題進(jìn)行闡述和討論。1植物內(nèi)生細(xì)菌植物內(nèi)生細(xì)菌名稱經(jīng)歷了近百年的發(fā)展,但內(nèi)生細(xì)菌的概念至今尚未統(tǒng)一。1866年DeBary首先將生活在植物組織內(nèi)的微生物與那些生長在植物表面的表生菌(epiphyte)相區(qū)別,提出了內(nèi)生菌(endophyte)的概念,認(rèn)為凡是在植物體內(nèi)的微生物均為內(nèi)生菌。1926年P(guān)erotti等在許多健康植物根部組織發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌,并用“bacteriorrhiza”(菌根)一詞對它們進(jìn)行描述,改變了人們關(guān)于“植物體內(nèi)無細(xì)菌”的認(rèn)識。這一發(fā)現(xiàn)被確定為“植物組織內(nèi)存在細(xì)菌”的起始點(diǎn)。此后大量研究進(jìn)一步證實(shí)了“植物健康組織內(nèi)存在內(nèi)生細(xì)菌”的觀點(diǎn)。1986年Carrol將內(nèi)生菌定義為生活在地上部分、活的植物組織內(nèi)而不引起明顯病害癥狀的微生物。1992年Kloepper等認(rèn)為,植物內(nèi)生菌是指能夠定殖于健康植物的各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi),并能與寄主植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物。1995年Wilson將內(nèi)生菌的定義擴(kuò)展為一生或一生中的某個(gè)階段能進(jìn)入活體植物組織內(nèi),并在植物組織內(nèi)不引起明顯組織變化的真菌或細(xì)菌。1997年Hallmann等將植物內(nèi)生細(xì)菌重新定義為:從表面消毒后的植物組織中分離到的或從植物內(nèi)部獲得的細(xì)菌,但它們的存在并不引起植物的表觀性狀和功能的改變。隨著植物內(nèi)生細(xì)菌研究的不斷深入,人們對內(nèi)生細(xì)菌的概念也在逐漸完善,目前以Wilson提出的內(nèi)生菌的概念被大多數(shù)研究者所支持和普遍采用。植物內(nèi)生細(xì)菌的傳統(tǒng)分離方法是研磨表面消毒后的植物組織,將勻漿液稀釋涂布平板,然后進(jìn)行分離和純化。傳統(tǒng)的內(nèi)生細(xì)菌分離方法具有簡便、易操作、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn),但該方法也存在一定的局限性。首先,由于部分內(nèi)生細(xì)菌難以模擬其生長繁殖的真實(shí)條件而不能獲得純培養(yǎng),導(dǎo)致非可培養(yǎng)細(xì)菌的種類和數(shù)量被忽視;其次,傳統(tǒng)方法分離內(nèi)生細(xì)菌時(shí)植物組織表面消毒方法以及消毒時(shí)間都會(huì)影響內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量調(diào)查的準(zhǔn)確性;再次,分離內(nèi)生細(xì)菌時(shí)所選用的培養(yǎng)基以及所用抗生素對內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和種類也存在一定的影響;此外,傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)人為地改變了內(nèi)生細(xì)菌本身的生境、微生物的群落結(jié)構(gòu)以及內(nèi)生細(xì)菌與寄主之間的相互作用,因此用傳統(tǒng)方法研究植物內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)及多樣性時(shí)存在較大的局限性。很多情況下傳統(tǒng)分類方法難以區(qū)分種內(nèi)的相似或相近菌株,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,通過對植物組織中細(xì)菌16SrDNA基因序列來鑒定植物組織中的內(nèi)生細(xì)菌的種類,該方法不需要對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng),直接以植物組織的基因組DNA為材料,減少了復(fù)雜的分離過程,并且其靈敏度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)分類方法,可全面地了解植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性的真實(shí)水平,該方法主要包括擴(kuò)增rDNA限制性分析(ARDRA),限制性片段長度多態(tài)性(RFLP),隨機(jī)片段擴(kuò)增多態(tài)性(AFLP),變性梯度凝膠電泳(DGGE),溫度梯度凝膠電泳(TGGE)及構(gòu)建16SrDNA克隆文庫等。分子生物學(xué)方法為內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性、動(dòng)態(tài)分布及其與根際土壤微生物的關(guān)系等的研究提供了更有效的技術(shù)手段。Conn等對澳大利亞小麥內(nèi)生細(xì)菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法相比,用分子手段得到的內(nèi)生細(xì)菌的多樣性較為豐富。2不同氮素合成內(nèi)生細(xì)菌在植物體中的定殖效率植物體是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng),在這個(gè)系統(tǒng)中多種微生物與植物體形成營養(yǎng)和競爭的小生境。在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中,內(nèi)生細(xì)菌之間、內(nèi)生細(xì)菌與植物之間形成了一系列互利共生關(guān)系,這使得內(nèi)生細(xì)菌能夠長期穩(wěn)定地定殖于植物體,并與植物體和諧共處。植物內(nèi)生細(xì)菌同根際細(xì)菌一樣,都受生物因子和非生物因子的限制,但植物內(nèi)生細(xì)菌抵御生物和非生物脅迫的能力比根際細(xì)菌要強(qiáng)。Siciliano等研究發(fā)現(xiàn),在污染地區(qū)對難降解物具有降解能力的細(xì)菌中,內(nèi)生細(xì)菌所占比例高于根際細(xì)菌,暗示了內(nèi)生細(xì)菌在這些難降解物的新陳代謝中發(fā)揮著重要作用。同時(shí),許多內(nèi)生細(xì)菌還參與土壤中磷元素的代謝,為植物提供有效磷素營養(yǎng),促進(jìn)植物生長,提高作物產(chǎn)量。Kuklinsky-Sobral等認(rèn)為大豆內(nèi)生細(xì)菌參與了磷的同化作用,表明內(nèi)生細(xì)菌具有溶磷能力,從而能有效促進(jìn)植物生長。內(nèi)生細(xì)菌在植物體中的定殖效率是其生防能力的一個(gè)關(guān)鍵性因素,然而,在自然環(huán)境中內(nèi)生細(xì)菌的定殖效率受到許多因素的影響。研究發(fā)現(xiàn),植物內(nèi)生細(xì)菌的定殖效率不僅與植物體本身有關(guān),還與內(nèi)生細(xì)菌自身的基因組及在植物體內(nèi)定殖的先后次序有關(guān)。在接種早期,內(nèi)生細(xì)菌的定殖效率因植物體不同而異;而到接種后期,內(nèi)生細(xì)菌在不同植物體中的定殖效率則無明顯差異。此外,Araujo等還發(fā)現(xiàn),內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的定殖將抑制其他內(nèi)生真菌的定殖,反之亦然。因此,在生物防治過程中,應(yīng)當(dāng)充分考慮到這些影響因素,盡可能地使內(nèi)生細(xì)菌的定殖效率處于一個(gè)最佳狀態(tài),充分發(fā)揮其應(yīng)有的生防作用。植物體中內(nèi)生細(xì)菌的種群和數(shù)量呈動(dòng)態(tài)分布,受植物生理機(jī)能的影響。內(nèi)生細(xì)菌與寄主之間存在雙向選擇,即內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨環(huán)境因子及寄主基因型的不同而發(fā)生改變;同時(shí)寄主植物也會(huì)根據(jù)環(huán)境的變化選擇合適的內(nèi)生細(xì)菌,來適應(yīng)環(huán)境的選擇壓力。Fuentes-Ramírez等研究發(fā)現(xiàn),與施低氮肥的甘蔗相比,施高氮肥的甘蔗中重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)的數(shù)量減少。這是由于施加氮肥后甘蔗的生理機(jī)能發(fā)生改變,蔗糖量下降,從而抑制了內(nèi)生細(xì)菌的生長和繁殖。Tan等的研究表明,對水稻施加氮肥后,水稻的內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生急劇變化。同時(shí),內(nèi)生細(xì)菌的接種方式及植物體的健康狀況對內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的成功定殖并發(fā)揮功能起著決定性作用。因此,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的定殖研究時(shí)應(yīng)避免選擇生長狀態(tài)不良的植株,并且要選用合適的接種方式,以期獲得可靠的結(jié)果。Reiter等發(fā)現(xiàn),與未被感染的馬鈴薯相比,被軟腐病菌(Erwiniacarotovora)侵染后的馬鈴薯中內(nèi)生細(xì)菌多樣性偏高。這可能是由于在內(nèi)生細(xì)菌體外定殖實(shí)驗(yàn)中,土壤固有細(xì)菌與內(nèi)生細(xì)菌之間的競爭較小,因此與自然界中內(nèi)生細(xì)菌的定殖能力相比,所得結(jié)果略微偏高。Afzal等對柴油污染地區(qū)的黑麥草進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌BurkholderiaphytofirmansPsJN接種試驗(yàn),采取4種不同的接種方式,最終發(fā)現(xiàn)灌根接種能夠使PsJN菌株實(shí)現(xiàn)最佳生防效果。3植物內(nèi)生細(xì)菌內(nèi)生細(xì)菌可長期穩(wěn)定地定殖于植物體,通過自身產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)和酶類,與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位,誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性及防衛(wèi)信號來持續(xù)抑制病原菌的生長和入侵[7,49,50,51,52,53]。當(dāng)前,內(nèi)生細(xì)菌已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病害的防治。如Gao等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Em7是油菜莖腐病的有效生防因子,溫室盆栽試驗(yàn)表明,菌株Em7對由核盤菌引起的油菜莖腐病的防治效果達(dá)到50%~70%。Aravind等將假單胞菌接種于黑胡椒干部和根部發(fā)現(xiàn)Pipercapsici的侵染率降低了90%;在根部接種綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌(P.putida)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)后P.capsici的侵染率降低60%。在根部接種藤黃短小桿菌(Curtobacteriumluteum)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)后土壤中線蟲數(shù)量減少70%以上。這些內(nèi)生細(xì)菌在防治病害的同時(shí)還對黑胡椒扦插苗的生長有促進(jìn)作用。同時(shí),內(nèi)生細(xì)菌還可用于林木病害的防治。Ren等自楊樹樹干分離到1株對楊樹潰瘍病菌有較強(qiáng)抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌BurkholderiapyrrociniaJK-SH007,該菌株能夠長期定殖于楊樹體內(nèi),并對楊樹的生長有一定的促進(jìn)作用。B.subtilis對小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt))有較強(qiáng)抗性,溫室灌根接種試驗(yàn)表明,將B.subtilis灌根接種于小麥根部后小麥全蝕病的發(fā)生率顯著降低,并對小麥有一定的促生作用;野外試驗(yàn)表明,B.subtilis對小麥全蝕病的防治效果達(dá)55.3%。因此,在農(nóng)業(yè)上可將B.subtilis用于防治小麥全蝕病的發(fā)生和危害。此外,內(nèi)生細(xì)菌在果蔬保鮮和果蔬采摘后腐爛病害的防治上也發(fā)揮著一定作用。與植物病害的防治相比,內(nèi)生細(xì)菌在害蟲防治上的應(yīng)用相對較少。Rajendran等在溫室條件下測定了棉花內(nèi)生細(xì)菌對美洲棉鈴蟲的防治效果。發(fā)現(xiàn)所分離的103株內(nèi)生細(xì)菌中有2株芽孢桿菌(Bacillus)和1株熒光假單胞菌(P.fluorescens)對美洲棉鈴蟲的防治效果最為明顯。將這3株內(nèi)生細(xì)菌制成生物菌劑,噴施棉花的種子、葉片及根際土壤,結(jié)果顯示美洲棉鈴蟲的發(fā)生率顯著降低,因此可將這3株內(nèi)生細(xì)菌作為生防菌來有效防治棉花蟲害。同時(shí),內(nèi)生細(xì)菌可作為構(gòu)建工程菌的理想載體,將外源固氮、抗病、殺蟲等基因?qū)胫参矬w中,增強(qiáng)植物的生長和抗逆能力。因此,對植物內(nèi)生細(xì)菌的基因工程研究受到越來越多的關(guān)注。目前,國內(nèi)外已經(jīng)對內(nèi)生細(xì)菌的基因工程改造開展了大量研究。相關(guān)研究表明,將Bt基因?qū)敫收?、玉米、棉花、水稻等?nèi)生細(xì)菌中后,植物本身具備了顯著的殺蟲能力,并且改造后的內(nèi)生細(xì)菌保持了固有的固氮、促生、抗病能力。黃玉杰等將枯草芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶基因?qū)氩耸暇鶥418,所得工程菌對大麗花輪枝胞、立枯絲核菌、麥根腐長蠕胞、禾谷絲核菌的抑菌效果顯著提高,并保持了原有的固氮、解磷、解鉀和促生作用,提高了菌株B418的生防能力。由此可見,基因改造后的內(nèi)生細(xì)菌具有更強(qiáng)的生防能力,能夠更好地應(yīng)用于植物病蟲害的生物防治。4內(nèi)生細(xì)菌對石油衍生物的降解能力植物內(nèi)生細(xì)菌具有凈化有毒廢棄物和環(huán)境污染物的能力,這種能力可能與生俱來,也可能后期由特定功能基因編碼獲得。Newman等發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌能增強(qiáng)植物對甲苯的耐受力以及抑制甲苯的揮發(fā),表明內(nèi)生細(xì)菌可以通過降解有毒物質(zhì)來補(bǔ)救植物。因此,可將某些內(nèi)生細(xì)菌開發(fā)為有毒物質(zhì)降解劑來加以利用。此外,內(nèi)生細(xì)菌還具有降解石油及其衍生物的能力。deOliveira等調(diào)查了瀝青泥污染地區(qū)的植物內(nèi)生細(xì)菌,測定了這些內(nèi)生細(xì)菌降解石油及其衍生物的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株均具有一定的降解能力,但隨降解時(shí)間不同,細(xì)菌的降解能力也隨之變化,且降解能力與時(shí)間不存在一定的相關(guān)性,但多數(shù)成分在48~72h基本都能被降解,這一結(jié)果可能與石油衍生物組分的復(fù)雜程度有關(guān)。大量研究還發(fā)現(xiàn),植物體內(nèi)存在著抗各類重金屬的內(nèi)生細(xì)菌,內(nèi)生細(xì)菌的存在增加了植物體內(nèi)重金屬的含量,提高了超積累植物富集重金屬的能力,促進(jìn)植物對土壤環(huán)境中重金屬的去除。此外,植物內(nèi)生細(xì)菌作為良好的外源基因載體已在植物修復(fù)中用于改善植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和固定重金屬特性,有望快速提高超積累植物抗性,提高植物修復(fù)效率。5生防菌的篩選原則主要解決了生內(nèi)生細(xì)菌幾乎存在于所有植物體內(nèi),在植物體內(nèi)長期穩(wěn)定定殖并傳導(dǎo),不易受外界環(huán)境條件干擾,并能促進(jìn)植物體的生長和發(fā)育、抵御病蟲侵襲,是寶貴的天然生物資源。隨著人們對自然環(huán)境保護(hù)意識的不斷加強(qiáng)及現(xiàn)代農(nóng)業(yè)逐步向生態(tài)型農(nóng)業(yè)發(fā)展,將內(nèi)生細(xì)菌替代化肥和農(nóng)藥來防治植物病、蟲害,既保持了植物微生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性,又實(shí)現(xiàn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。植物內(nèi)生細(xì)菌作為生防因子在實(shí)驗(yàn)室研究中取得了一定的成效,但將其釋放到自然環(huán)境中尚需解決一些問題。首先,當(dāng)前所研究的植物生防內(nèi)生細(xì)菌大多是在實(shí)驗(yàn)室平板上篩選得到的,在篩選內(nèi)生細(xì)菌時(shí)人們常以一種或少數(shù)幾種病原菌作為篩選條件,導(dǎo)致所篩選的內(nèi)生細(xì)菌生防能力單一,綜合防治效果差,應(yīng)用范圍窄等問題。因此,在篩選生防菌時(shí)我們應(yīng)當(dāng)選取多種病原菌作為篩選目標(biāo),并將多種菌劑配合使用,來提高植物內(nèi)生細(xì)菌的綜合防治效果。其次,不同植物或不同組織中內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量、種類和基因型不盡相同,寄主植物對某種特殊內(nèi)生細(xì)菌基因型的敏感性會(huì)隨環(huán)境的變化而改變,生態(tài)環(huán)境和植物體微生態(tài)系統(tǒng)中的許多因子都會(huì)影響內(nèi)生細(xì)菌生防作用的穩(wěn)定發(fā)揮,從而在一定程度上制約了內(nèi)生細(xì)菌的生防效果。因此,利用內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物防治時(shí)不僅要考慮內(nèi)生細(xì)菌的生物穩(wěn)定性,還要考慮植物體自身的微生態(tài)環(huán)境及其所處的自然條件等因素。此外,目前內(nèi)生細(xì)菌的研究主要集中在農(nóng)業(yè)上,