實(shí)時熒光定量PCR介紹

實(shí)時熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司10/9/2023主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識12RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實(shí)例實(shí)時熒光定量PCR介紹210/9/2023RealTimePCR基礎(chǔ)知識1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識1實(shí)時熒光定量PCR介紹310/9/2023RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測差異顯示結(jié)果驗(yàn)證基因芯片結(jié)果驗(yàn)證siRNA效果確認(rèn)mRNA表達(dá)量分析病毒及病原菌檢測物種鑒定基因分型絕對定量相對定量實(shí)時熒光定量PCR介紹410/9/2023RealTimePCR的原理

激發(fā)光發(fā)射光使用RealTimePCR擴(kuò)增裝置實(shí)時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。RealTimePCRCt值實(shí)時熒光定量PCR介紹510/9/2023RealTimePCR基礎(chǔ)知識1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識1實(shí)時熒光定量PCR介紹610/9/2023TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI熒光染料嵌合法熒光探針法RealTimePCR的檢測方法實(shí)時熒光定量PCR介紹710/9/2023熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一種能結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的 具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI實(shí)時熒光定量PCR介紹810/9/2023Primer退火FFFFSYBRGreenI法作用機(jī)理示意圖Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer熱變性FFFF實(shí)時熒光定量PCR介紹910/9/2023TaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，5’端標(biāo)記一個報告基團(tuán)（Reporter），3’端標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)（Quencher）。RQ實(shí)時熒光定量PCR介紹1010/9/2023RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性退火延伸TaqManProbe法原理示意圖

實(shí)時熒光定量PCR介紹1110/9/2023One-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢出Probe設(shè)計要求高

Probe法

Probe合成費(fèi)用高SYBRGreenI法與Probe法比較常用于mRNA表達(dá)量分析等SYBRGreenI法

簡便易行價格便宜要求反應(yīng)的特異性不能進(jìn)行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌檢測實(shí)時熒光定量PCR介紹1210/9/2023主要內(nèi)容2RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RealTimePCR反應(yīng)實(shí)時熒光定量PCR介紹1310/9/2023RT

Primer的選擇

RandomPrimer

OligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer實(shí)時熒光定量PCR介紹1410/9/2023目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以內(nèi)適用，RT效率較高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表達(dá)量分析最適。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random適用于mRNA表達(dá)量分析，提升反應(yīng)檢測的靈敏度。RT

Primer的選擇實(shí)時熒光定量PCR介紹1510/9/2023RealTimePCR引物設(shè)計目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計要求不同=>對引物設(shè)計要求嚴(yán)格普通PCR引物RealTimePCR引物實(shí)時熒光定量PCR介紹1610/9/2023兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)

★GC含量Primer長度80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))★擴(kuò)增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性★★★特異性

△

引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列

△

引物3’末端避免2base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性3’末端序列

△

整體上堿基不能過偏

△

個別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)

△

避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)★序列★

△

3’末端避免GCrich或ATrich

△

3’末端堿基最好為G或C

△

3’末端堿基盡量避免為T盡量在Exonjunction上設(shè)計引物，限制基因組DNA擴(kuò)增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物設(shè)計原則實(shí)時熒光定量PCR介紹1710/9/2023探針的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe長度探針5’末端的第一個堿基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相對較高的區(qū)域設(shè)計

△整體上堿基不能過偏

△個別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)；避免T/C

連續(xù)，A/C連續(xù)★序列Probe內(nèi)部或Probe與兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性BLAST檢索確認(rèn)Probe特異性★★★特異性RealTimePCR用TaqMan探針設(shè)計原則RealTimePCR探針設(shè)計原則實(shí)時熒光定量PCR介紹1810/9/2023線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.235Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。NoTemplateControl確認(rèn)30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98反應(yīng)性能確認(rèn)實(shí)時熒光定量PCR介紹1910/9/2023主要內(nèi)容3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法實(shí)時熒光定量PCR介紹2010/9/2023標(biāo)準(zhǔn)曲線制作擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇：5～6個梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為10105104103102101100

105

104103102101100實(shí)時熒光定量PCR介紹2110/9/2023標(biāo)準(zhǔn)品的種類基因組DNA

質(zhì)粒TotalRNA&cDNA

體外轉(zhuǎn)錄RNADNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品

RNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時熒光定量PCR介紹2210/9/2023質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程基因組DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取，OD值定量。將質(zhì)粒梯度稀釋至105-101copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)時熒光定量PCR介紹2310/9/2023體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程RNA純化后，測OD定量。將RNA梯度稀釋至105-101copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。T7RNApolymerase體外轉(zhuǎn)錄RNATotalRNAPCRcDNARTT7PromoterTTTT???TPCR產(chǎn)物目的基因目的基因目的基因AAAA???AAAAA???A實(shí)時熒光定量PCR介紹2410/9/2023理想的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線基線平整NegativeControl為水平線指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大平臺區(qū)匯于一起線性范圍寬實(shí)時熒光定量PCR介紹2510/9/2023理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線

相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。擴(kuò)增效率

相關(guān)系數(shù)

擴(kuò)增效率（E）計算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示起始模板濃度（log10)，Y軸表示Ct值時

E=10-1/a-1

標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示Ct值，Y軸表示起始模板濃度（log10)E=10-a-1實(shí)時熒光定量PCR介紹2610/9/2023RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法實(shí)時熒光定量PCR介紹2710/9/2023融解曲線分析

Tm值是指雙鏈DNA分子解鏈一半時的溫度。

SYBRGreenI法進(jìn)行檢出時，要根據(jù)融解曲線確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。實(shí)時熒光定量PCR介紹2810/9/2023特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體對PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析融解曲線分析實(shí)時熒光定量PCR介紹2910/9/20233RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法Real