原核基因表達調(diào)控(2)-08

第六章基因的表達與調(diào)控(上)

——原核基因表達調(diào)控模式石曉衛(wèi)細胞工程教研室E-mail:xwshi205@126.com第四節(jié)色氨酸操縱子（trpoperon）內(nèi)容提要：色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)色氨酸操縱子的阻遏系統(tǒng)色氨酸操縱子的弱化機制

調(diào)控基因結(jié)構(gòu)基因

催化分枝酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼岬拿?/p>

trpRtrp一、色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)trpR,阻遏蛋白P，-40~+18

O,-21~+1L,+1~+162結(jié)構(gòu)基因t,A下游36bp,

t＇,t下游250bp，基因組成磷特點:(1)trpR和trpABCDE不連鎖（相距很遠）；

(2)操縱基因在啟動子內(nèi)；

(3)有衰減子(attenuator)/弱化子；(4)啟動子和結(jié)構(gòu)基因不直接相連，二者被前導(dǎo)序列(Leader)所隔開。二、trp操縱子的阻遏系統(tǒng)低Trp時：阻遏物不結(jié)合操縱基因；高Trp時：阻遏物+Trp

結(jié)合操縱基因1、TrpR

四聚體阻遏蛋白＋trp→

有活性的阻遏物SNE299＋trpO→不轉(zhuǎn)錄2、阻遏蛋白的結(jié)合位點

trpO-21~+1，反向重復(fù)序列trpP-40~+18活性阻遏物與trpO的結(jié)合與RNApol與啟動子的結(jié)合發(fā)生競爭。操縱子3、阻遏系統(tǒng)主管轉(zhuǎn)錄是否啟動粗調(diào)開關(guān)三、trp操縱子的弱化機制衰減子（attenuator）/弱化子前導(dǎo)序列（leadersequence）1.弱化子：

DNA中可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過早終止的一段核甘酸序列（123-150bp區(qū)）。123~150RepressormRNAtrprepressor

研究引起終止的mRNA堿基序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)mRNA通過自我配對可以形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，有典型的終止子特點。POE4321LDNARNAATGTGA2trpcodons14322.前導(dǎo)肽

前導(dǎo)肽14aa3.前導(dǎo)序列：在trpmRNA5'端trpE基因的起始密碼前一個長162bp的mRNA片段。4、弱化機制

研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度Trp和低濃度Trp時，Trp操縱子的表達水平相差600倍，然而阻遏作用僅使轉(zhuǎn)錄降低70倍。另外使阻遏物失活突變不能完全消除Trp對Trp操縱子表達的影響。說明Trp操縱子的這種調(diào)控與阻遏物的控制無關(guān)。這就是弱化作用。

阻遏系統(tǒng)是一個粗調(diào)開關(guān)，主管轉(zhuǎn)錄是否啟動；Trp操縱子對應(yīng)于Trp的生物合成還有另一個系統(tǒng)進行細微調(diào)控，并決定已經(jīng)啟動的轉(zhuǎn)錄是否進行下去。在這個系統(tǒng)中酶的濃度根據(jù)氨基酸濃度的變化而受到調(diào)節(jié)。這個細微調(diào)控是通過轉(zhuǎn)錄達到第一個結(jié)構(gòu)基因之前的過早終止來實現(xiàn)的，細胞中色氨酸的濃度是實現(xiàn)過早終止的根本原因。

1︰2暫停結(jié)構(gòu)2︰3抗終止構(gòu)型3︰4終止構(gòu)型UUUU……34UUUU3’34核糖體前導(dǎo)肽前導(dǎo)mRNA1.當(dāng)色氨酸濃度高時轉(zhuǎn)錄衰減機制125’

trp密碼子衰減子結(jié)構(gòu)就是終止子可使轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)DNAUUUU3’

RNA聚合酶終止UUUU……342423UUUU……核糖體前導(dǎo)肽前導(dǎo)mRNA15’

trp密碼子

結(jié)構(gòu)基因前導(dǎo)DNA

RNA聚合酶2.當(dāng)色氨酸濃度低時Trp合成酶系相關(guān)結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄序列3、4不能形成衰減子結(jié)構(gòu)為什么需要阻遏體系？

當(dāng)大量Trp存在時，阻遏系統(tǒng)起作用，阻遏物與之結(jié)合，阻止非必需的先導(dǎo)mRNA合成，使這個合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟。trp操縱子具有雙重調(diào)節(jié)體系？阻遏作用與弱化作用的協(xié)調(diào)為什么需要弱化系統(tǒng)？

當(dāng)trp濃度低時，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，速度極慢，不能很快引發(fā)trp合成。因此需要一個能快速作出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)腡rp水平。

弱化子能較快地通過抗終子的方法來增加Trp基因表達，迅速提高內(nèi)源色氨酸的濃度。

細菌通過弱化作用彌補阻遏作用的不足，因為阻遏作用只能使轉(zhuǎn)錄不起始，對于已經(jīng)起始的轉(zhuǎn)錄，只能通過弱化作用使之中途停下來。阻遏作用的信號是細胞內(nèi)色氨酸的多少；弱化作用的信號則是細胞內(nèi)載有色氨酸的tRNA的多少。它通過前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進行，在細菌細胞內(nèi)這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內(nèi)周密的調(diào)控作用。細菌演化出弱化系統(tǒng)的生物學(xué)意義

通過tRNA荷載與否進行調(diào)控，更為靈敏；氨基酸的主要用途是合成蛋白質(zhì)，因而以tRNA荷載為標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)控更為恰當(dāng)；兩個調(diào)控系統(tǒng)，避免浪費提高效率：阻遏系統(tǒng)高水平trp時，不轉(zhuǎn)錄

低水平trp時，轉(zhuǎn)錄

弱化系統(tǒng)細調(diào)原核生物細致的精細調(diào)控機制增強原核生物對環(huán)境的適應(yīng)性

經(jīng)濟Contents基因表達調(diào)控的基本概念原核基因調(diào)控機制乳糖操縱子色氨酸操縱子其他操縱子轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控第五節(jié)其他操縱子一、半乳糖操縱子(galactoseoperon)異構(gòu)酶(galE)乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶(galT)

半乳糖激酶(galk)gal操縱子的特點：①它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點開始轉(zhuǎn)錄；②它有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游，另一個在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。因為半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人們猜想葡萄糖存在時半乳糖操縱子不被誘導(dǎo)，但實際上有葡萄糖存在時，gal操縱子仍可被誘導(dǎo)。現(xiàn)已分離到一些突變株，其中一類突變株能在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中高水平合成半乳糖代謝酶類（gal結(jié)構(gòu)基因高效表達）；而另一類突變株中g(shù)al基因的表達完全依賴于葡萄糖，培養(yǎng)基中如無葡萄糖存在，這些細菌的gal基因不表達，不合成半乳糖代謝酶類。分析gal操縱子P-O區(qū)的DNA序列發(fā)現(xiàn)，該操縱子確實存在兩個相距僅5bp的啟動子，可以分別起始mRNA的合成。每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點S1和S2。從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在培養(yǎng)基中無葡萄糖時，才能順利進行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CAP和較高濃度的cAMP。從S2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由這個啟動子起始的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有cAMP-CAP時，轉(zhuǎn)錄從S1開始，當(dāng)無cAMP-CAP時，轉(zhuǎn)錄從S2開始。S1S2S1起始的轉(zhuǎn)錄不依賴于葡萄糖S2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖為什么gal操縱子需要兩個轉(zhuǎn)錄起始位點？半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關(guān)的物質(zhì)--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細胞壁合成的前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差向異構(gòu)酶（來源？）的作用由UDP-葡萄糖合成的，該酶是galE基因的產(chǎn)物。生長過程中的所有時間里細胞必須能夠合成差向異構(gòu)酶?，F(xiàn)在設(shè)想只有S1一個啟動子，那么由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時就不能合成異構(gòu)酶。S1S2半乳糖存在、葡萄糖不存在時，S1啟動S1S2假如唯一的啟動子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情況下，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導(dǎo)狀態(tài)，這無疑是一種浪費。無論從必要性或經(jīng)濟性考慮，都需要一個不依賴于cAMP-CAP的啟動子（S2）進行本底水平的組成型合成，以及一個依賴于cAMP-CAP的啟動子（S1）對高水平合成進行調(diào)節(jié)。即只有在S2活性完全被cAMP-CAP抑制時，調(diào)控作用才是有效的。半乳糖、葡萄糖存在時，S2啟動，浪費半乳糖不存在、葡萄糖存在時，S2啟動，組成型合成二、阿拉伯糖操縱子（arabinoseoperon)araB基因、araA基因和araD,形成一個基因簇，簡寫為araBAD。三個基因的表達受到ara操縱子中araC基因產(chǎn)物AraC蛋白的調(diào)控。ara操縱子的調(diào)控特點：第一，araC表達受到AraC的自身調(diào)控。第二，AraC既是ara操縱子的正調(diào)節(jié)蛋白，又是其負調(diào)節(jié)蛋白。這種雙重功能是通過AraC蛋白的兩種異構(gòu)體來實現(xiàn)的（Pi和Pr)。第三，AraC與CAP結(jié)合可充分誘導(dǎo)ara操縱子。

與araBAD相鄰的是一個復(fù)合的啟動子區(qū)域和一個調(diào)節(jié)基因araC，這個AraC蛋白同時顯示正、負調(diào)節(jié)因子的功能。AraBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進行的。在標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)圖譜上，araBAD基因簇從啟動子PBAD開始向左進行轉(zhuǎn)錄，而araC基因則是從Pc向右轉(zhuǎn)錄。高葡萄糖，低阿拉伯糖有阿拉伯糖，無葡萄糖無araC蛋白時AraC蛋白作為PBAD活性正、負調(diào)節(jié)因子的雙重功能是通過該蛋白的兩種異構(gòu)體來實現(xiàn)的。Pr是起阻遏作用的形式，可以與現(xiàn)在尚未鑒定的類操縱區(qū)位點相結(jié)合，而Pi是起誘導(dǎo)作用的形式，它通過與PBAD啟動子結(jié)合進行調(diào)節(jié)。在沒有阿拉伯糖時，Pr形式占優(yōu)勢；一旦有阿拉伯糖存在，它就能夠與AraC蛋白結(jié)合，使平衡趨向于Pi形式。這樣，阿拉伯糖的誘導(dǎo)作用就可以解釋為阿拉伯糖與Pr的結(jié)合，使Pr離開它的結(jié)合位點，然后，產(chǎn)生大量的Pi，并與啟動子結(jié)合。培養(yǎng)基中含有葡萄糖，沒有阿拉伯糖：cAMP-CAP沒有與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白處于Pr形式并與A位點結(jié)合，RNA聚合酶很少再與Pc結(jié)合，araC基因雖然仍有轉(zhuǎn)錄，但受到抑制，只有少量AraC蛋白形成，整個系統(tǒng)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)。沒有葡萄糖，也沒有阿拉伯糖：因為沒有誘導(dǎo)物，盡管有cAMP-CAP與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白仍以Pr形式為主，無法與操縱區(qū)B位點相結(jié)合，無araBADmRNA轉(zhuǎn)錄。無葡萄糖，有阿拉伯糖時：大量araC基因產(chǎn)物以Pi形式存在，并分別與操縱區(qū)B、A位點相結(jié)合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表達，操縱子充分激活。A位點B位點araC的表達受到自身產(chǎn)物AraC的自動調(diào)控。當(dāng)沒有阿拉伯糖時，AraC起著一個轉(zhuǎn)錄阻遏物的作用。細胞中AraC蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)水平的測量表明，阻遏araC轉(zhuǎn)錄大約需要40個AraC。因此當(dāng)AraC蛋白水平低時（就是說在細胞剛分裂之后），araC將表達直至存在足夠的AraC去阻遏它的轉(zhuǎn)錄。阿拉伯糖作為E.Coli的碳源，可以誘導(dǎo)ara操縱子的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細胞中葡萄糖水平高（導(dǎo)致cAMP處于低濃度）和阿拉伯糖水平低時，AraC阻遏araB，araA，araD的轉(zhuǎn)錄。然而當(dāng)阿拉伯糖水平高，而葡萄糖水平低（cAMP高）時，CAP-cAMP復(fù)合物能夠與ara操縱子中的CAP結(jié)合部位結(jié)合，使DNA環(huán)打開。

阿拉伯糖的作用象AraC的一個調(diào)控器，可將AraC由一個阻遏物轉(zhuǎn)換為一個激活劑。阿拉伯糖與AraC結(jié)合似乎改變了AraC同源二聚體化特性和促進了AraC-CAP復(fù)合物的形成。在這樣的條件下，AraC－阿拉伯糖的作用象是一個轉(zhuǎn)錄激活劑，這正是CAP-cAMP誘導(dǎo)araB，araA，araD轉(zhuǎn)錄所需要的。

當(dāng)由于araBAD編碼的蛋白質(zhì)的代謝使得阿拉伯糖水平下降時，AraC又轉(zhuǎn)換成一個阻遏物，同時araBAD轉(zhuǎn)錄減少，此時盡管CAP-cAMP復(fù)合物仍然存在于細胞中。有趣的是，當(dāng)葡萄糖和阿拉伯糖都很豐富時，ara操縱子被阻遏，但阻遏的道理現(xiàn)在還不完全清楚，但這個結(jié)果表明