基質(zhì)層在暗背景下被襯托的細(xì)胞核

基質(zhì)層在暗背景下被襯托的細(xì)胞核

【摘要】目的：用HRTⅡ代/Rostock角膜模塊對正常人眼角膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析。方法：應(yīng)用激光共焦顯微鏡對46例正常人的中央角膜，上下方角膜緣進(jìn)行檢查分析。結(jié)果：上下方角膜緣可觀察到Vogt柵欄狀結(jié)構(gòu)，并可動態(tài)觀察到血細(xì)胞在血管內(nèi)流動。上下方角膜緣表層上皮細(xì)胞密度低于中央表層上皮細(xì)胞。Langerhans細(xì)胞位于角膜35~60μm處，其形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞核較大且樹枝狀突起較多或者核較小且突起較少，可能分別代表Lcs處于成熟和未成熟狀態(tài)。Lcs平均密度角膜緣明顯高于角膜中央，角膜中央Lcs不可計(jì)數(shù)。正常人角膜上皮基底細(xì)胞下層神經(jīng)排列較規(guī)則，平行走行，深層神經(jīng)纖維較淺層神經(jīng)纖維粗大，彎曲度小，少見分支，纖維之間的交聯(lián)很少，神經(jīng)串珠清晰可見。角膜中央前基質(zhì)細(xì)胞與后基質(zhì)細(xì)胞平均密度相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。角膜中央厚度為551±39μm。結(jié)論：激光共焦顯微鏡能在三維空間、實(shí)時(shí)、活體條件下對角膜組織進(jìn)行無損傷的光學(xué)斷層掃描成像，觀察角膜各層細(xì)胞、神經(jīng)及膠原等形態(tài)結(jié)構(gòu)，并可研究其動態(tài)變化，具有廣闊的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】角膜Langerhans細(xì)胞激光共焦顯微鏡

海德堡視網(wǎng)膜斷層掃描系統(tǒng)Ⅱ代是利用共聚焦激光的原理獲取和定量分析眼后節(jié)三維形態(tài)的儀器，通過增加Rostock角膜模塊組，HRTⅡ可以轉(zhuǎn)變成共焦激光角膜顯微鏡，用來獲取和分析角膜各層面二維圖像和整個(gè)角膜的三維圖像。我們應(yīng)用HRTⅡ代/RCM檢查了92個(gè)正常人角膜，為進(jìn)一步研究各種角膜疾病提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1對象和方法

研究對象46例受檢者來自2006年10月~2007年2月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科接受屈光手術(shù)術(shù)前檢查及常規(guī)體檢者，其中男20例，女26例，年齡20~61歲，平均±歲。所有受檢眼均無外傷、感染及配戴接觸鏡史，經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查角膜透明，檢眼鏡檢查無異常。作為正常健康眼入選本研究。

激光共焦顯微鏡檢查表面麻醉后滴50ulVidisic眼凝膠于物鏡頭表面，蓋上一次性無菌角膜接觸帽；移動固視燈令其向下看，在CCD攝取的監(jiān)控圖像的指導(dǎo)下，調(diào)整物鏡位置直至激光光束位于上方角膜緣中央；前移物鏡至接觸帽與之輕微接觸，預(yù)設(shè)置兩者接觸的焦平面深度為0μm；轉(zhuǎn)動焦平面調(diào)節(jié)環(huán)以獲得角膜不同深度不同層次的圖像；根據(jù)所獲圖像的真實(shí)焦平面位置進(jìn)行調(diào)整；移動固視燈改變被檢者注視方向，檢查上方角膜緣，中央角膜及結(jié)膜細(xì)胞；選擇有價(jià)值的圖像與錄像存盤。

圖像分析與統(tǒng)計(jì)參數(shù)利用HRTII/RCM軟件分析系統(tǒng)，計(jì)算角膜各層細(xì)胞的平均密度。其中將角膜上皮分為3層：表層上皮細(xì)胞層、翼狀上皮細(xì)胞層和基底上皮細(xì)胞層，分別計(jì)算中央角膜及上下方角膜緣表層上皮細(xì)胞層，中央角膜翼狀上皮細(xì)胞層，基底上皮細(xì)胞層的細(xì)胞平均密度；將角膜基質(zhì)層分為兩段，計(jì)算前基質(zhì)層，后基質(zhì)層掃描圖像的細(xì)胞密度；分析角膜上皮基底細(xì)胞層下的神經(jīng)，1幅圖像內(nèi)所有神經(jīng)纖維分支的總數(shù)量為神經(jīng)數(shù)量；計(jì)算上下方角膜緣Langerhans細(xì)胞及中央角膜內(nèi)皮細(xì)胞的平均密度；角膜厚度是指角膜接觸帽到內(nèi)皮細(xì)胞之間的距離。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Rostock操作軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用x±s表示，每兩組細(xì)胞平均密度數(shù)值之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異應(yīng)用配對t檢驗(yàn)，以P<作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

共焦顯微鏡檢查的92眼中，獲得角膜中央上皮表層細(xì)胞圖像20眼，獲得角膜緣表層上皮細(xì)胞圖像29眼，獲得角膜緣Langerhans細(xì)胞圖像59眼，獲得角膜中央Langerhans細(xì)胞圖像28眼，獲得角膜上皮翼狀細(xì)胞層、基底細(xì)胞層、前基質(zhì)層和后基質(zhì)層圖像92眼，獲得內(nèi)皮圖像90眼，對所有圖像進(jìn)行形態(tài)學(xué)和細(xì)胞密度分析如下。

上皮層正常的表層上皮細(xì)胞排列疏松，邊界清晰，呈多角形，以六邊形為主，胞核明亮。角膜中央表層上皮細(xì)胞平均密度為1124±290個(gè)/mm2，上下方角膜緣表層上皮細(xì)胞平均密度分別為847±302個(gè)/mm2和803±293個(gè)/mm2。上下方角膜緣表層上皮細(xì)胞密度相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。翼狀細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞向側(cè)面延伸變細(xì)，形似翼狀，邊界清晰，胞核反光較弱。角膜中央翼狀細(xì)胞層細(xì)胞平均密度為4279±270個(gè)/mm2?；准?xì)胞近似圓形，排列緊密，邊界明亮，胞質(zhì)和胞核反光弱。角膜中央基底細(xì)胞平均密度為6513±422個(gè)/mm2。

角膜緣Vogt柵欄狀結(jié)構(gòu)和Langerhans細(xì)胞用共焦顯微鏡可觀察到角膜緣Vogt柵欄狀結(jié)構(gòu)：角膜緣上皮細(xì)胞層數(shù)增多向深層增生形成上皮柱，上皮柱之間的結(jié)締組織向上突起形成指狀突起，上皮柱和指狀突起有規(guī)律地交替排列。動態(tài)觀察到血細(xì)胞在血管內(nèi)的流動。Langerhans細(xì)胞位于角膜35~60μm處，絕大多數(shù)Lcs位于基底上皮細(xì)胞層和前彈力層，少量Lcs位于翼狀上皮細(xì)胞層深部。其形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞核較大且樹枝狀突起較多或者核較小且突起較少，可能分別代表Lcs處于成熟和未成熟狀態(tài)[1]。上方和下方角膜緣Lcs平均密度分別為184±25個(gè)/mm2，175±23個(gè)/mm2。兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lcs平均密度角膜緣明顯高于角膜中央，角膜中央Lcs不可計(jì)數(shù)。

中央角膜上皮基底層下神經(jīng)纖維Bowman膜在共焦顯微鏡下無形態(tài)及結(jié)構(gòu)。正常人角膜上皮基底細(xì)胞下層神經(jīng)排列比較規(guī)則，平行走行，淺層神經(jīng)纖維彎曲度較大，神經(jīng)纖維分支較多，深層神經(jīng)纖維粗大，彎曲度小，少見分支，纖維之間的交聯(lián)很少，神經(jīng)串珠清晰可見。中央角膜上皮基底層下神經(jīng)纖維的數(shù)量為±支/幅。觀察視野為380μm×380μm。神經(jīng)纖維叢旁邊偶見明亮的Langerhans細(xì)胞，細(xì)胞密度不可計(jì)數(shù)，形態(tài)不規(guī)則。

基質(zhì)層在圖像的暗背景下被襯托出發(fā)亮的細(xì)胞核，核間有不定形的黑色背景分割。細(xì)胞核形態(tài)為成骨細(xì)胞狀、紡錘狀及橢圓形，窺不清細(xì)胞胞漿、細(xì)胞邊緣及板層膠原。基質(zhì)細(xì)胞的密度以Bowman膜下的最高。角膜中央前基質(zhì)細(xì)胞平均密度為1130±96個(gè)/mm2，后基質(zhì)細(xì)胞平均密度為778±53個(gè)/mm2。兩者之間細(xì)胞密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，在前中基質(zhì)層可見粗大的分支狀的神經(jīng)干。

內(nèi)皮細(xì)胞層及角膜厚度角膜內(nèi)皮細(xì)胞呈六邊形，細(xì)胞邊界