冷凍超低溫保存對(duì)豬精子膜完整性及氧化應(yīng)激水平的影響

冷凍超低溫保存對(duì)豬精子膜完整性及氧化應(yīng)激水平的影響

該精髓的長(zhǎng)期保存對(duì)動(dòng)物育種、低溫生物學(xué)資源的保存和動(dòng)物基因的實(shí)驗(yàn)研究非常重要。精液的長(zhǎng)期保存盡管具有潛在優(yōu)勢(shì),但眾所周知,豬精子對(duì)低溫非常敏感,豬冷凍保存精液應(yīng)用于人工授精的比例尚不足1%,存在冷凍保存精液活力差、受胎率低、產(chǎn)仔數(shù)少等諸多問(wèn)題。超低溫保存技術(shù)是重要的輔助生殖技術(shù)。精子超低溫保存時(shí),冷凍損傷是難以避免的,其主要作用機(jī)制是在冷凍過(guò)程中,冰晶的形成和滲透壓改變導(dǎo)致精子受損。另外,在生理狀態(tài)下,作為有氧代謝的產(chǎn)物,適量的活性氧(ROS)可調(diào)節(jié)精子功能,但過(guò)高的ROS水平則使精子膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),引起精子損傷。本研究以豬新鮮和冷凍—解凍精液為研究對(duì)象,探討超低溫保存對(duì)精子膜完整性及氧化應(yīng)激的影響。1材料和方法1.1低場(chǎng)提供服務(wù)4只成年、健康、性欲旺盛的姜曲海種公豬,由國(guó)家級(jí)姜曲海種豬場(chǎng)提供。利用手握法采集精液,立即置于保溫桶中,1h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室;將精液用專(zhuān)用濾紙過(guò)濾至37℃預(yù)熱燒杯中,然后使用德國(guó)米尼圖MII稀釋劑,按照體積比1∶1.5進(jìn)行稀釋。1.2稀釋液和冷凍溶液的制備1.2.1雙蒸水液的制備分別稱(chēng)取葡萄糖1.1g、Tris2.42g、檸檬酸鈉1.48g、青霉素0.06g和鏈霉素0.1g,溶解于雙蒸水中,定容至100mL。1.2.2添加十二烷基磺酸鈉sds和20%卵黃冷凍Ⅰ液(試驗(yàn)設(shè)計(jì)為2組):(1)冷凍1組:在稀釋液的基礎(chǔ)上添加375mmol/L海藻糖、0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)和20%卵黃;(2)冷凍2組:在冷凍1組基礎(chǔ)上添加0.05%維生素C。冷凍Ⅱ液:在冷凍1組的基礎(chǔ)上添加甘油,使其終濃度為3%。1.3冷凍液制備將1∶1.5稀釋后的精液置于17℃過(guò)夜,17℃800g離心12min,棄上清,然后加入冷凍Ⅰ液于4℃平衡1.5h;再加入等體積4℃預(yù)冷的冷凍Ⅱ液,使精液最終稀釋比為1∶2,然后再于4℃平衡、分裝于0.25mL細(xì)管中,4℃平衡、分裝時(shí)間在45min內(nèi)完成,距液氮面3cm熏蒸10min后投入液氮保存1周。解凍時(shí),將細(xì)管從液氮中迅速取出,直接投入37℃水浴中并迅速搖晃。將解凍后的精液收集于10mL試管內(nèi),然后用9倍體積的PBS液清洗精子。1.4精子的計(jì)數(shù)于相差顯微鏡下直接觀察活精子的正常形態(tài)率,至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子。將巨型精子、短小精子、雙頭或雙尾精子以及精子頂體膨脹或脫落、精子頭部殘缺或與尾部分離、尾部變曲等,均視為畸形精子。1.5為精細(xì)膜的完整性檢測(cè)1.5.1熒光顯微鏡觀察100μLHEPES/BSA(0.7599gNaCl、0.0298gKCl、0.2383gHEPES、0.1gBSA、0.2522g果糖、0.102gMgCl2·6H2O、0.0147gCaCl2·2H2O,溶解于100mL蒸餾水)中加入2μL碘化丙啶(PI,0.025g溶于10mLPBS),再加入精液懸液50μL,37℃孵育30min;取10μL精液懸液滴于載玻片中央,滴加少量抗熒光淬滅劑DABCO(甘油∶PBS體積比為9∶1的10mL溶液中含DABCO0.02468g),蓋片,用無(wú)色指甲油封片,在熒光顯微鏡(Nikon,T1-SM)下觀察。PI染色陽(yáng)性者為頭部精子質(zhì)膜破損的死精子,其頭部核區(qū)呈現(xiàn)紅色熒光。1.5.2精子的獲得100μL低滲液(準(zhǔn)確稱(chēng)取二水檸檬酸鈉0.735g、果搪1.351g,加雙蒸水至100mL,滲透壓為150mOsm/kg,0.22μm濾膜過(guò)濾,4℃保存?zhèn)溆?中加入10μL精子,然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30min;取10μL置于載玻片上,加蓋蓋玻片,于顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)精子,計(jì)算尾部腫脹(彎尾)精子(即尾部質(zhì)膜完整率)的百分率。1.6丙二醇mda的活性和超氧化物誘導(dǎo)酶sod的含量SOD活性及MDA含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定,操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.7處理數(shù)據(jù)每組重復(fù)3次,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1質(zhì)膜完整率和體長(zhǎng)質(zhì)膜完整率由表1可見(jiàn),經(jīng)冷凍—解凍后,豬精子形態(tài)正常率、頭部質(zhì)膜完整率及尾部質(zhì)膜完整率均顯著降低;冷凍1組精子形態(tài)正常率、頭部質(zhì)膜完整率及尾部質(zhì)膜完整率分別為71.2%、57.2%、49.2%,均顯著低于冷凍2組。2.2兩組mda含量比較由表2可見(jiàn),經(jīng)冷凍—解凍后,豬精子SOD活性顯著低于新鮮對(duì)照組(114.7IU/10-8),MDA含量則顯著高于對(duì)照組(22.7nmol/g);冷凍1組和冷凍2組相比,前者SOD活性為85.3IU/10-8,顯著低于后者(96.7IU/10-8),前者M(jìn)DA含量為36.2nmol/g,顯著高于后者(31.2nmol/g)。3冷凍—小結(jié)與討論精子經(jīng)歷超低溫保存,冷凍—解凍造成的損傷是難以避免的,其中精子質(zhì)膜是最容易受損的部位,而精子受精能力與精子膜結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)。精子膜富含多聚不飽和脂肪酸,是維持膜流動(dòng)性和精子完成活能、頂體反應(yīng)及透明帶反應(yīng)的基礎(chǔ)。SOD作為精子主要的抗氧化酶之一,其作用是清除氧化分解過(guò)程中產(chǎn)生的自由基,從而起到保護(hù)作用。MDA是精子膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一,一定程度上可反映精子膜脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷情況。在本試驗(yàn)中,冷凍—解凍導(dǎo)致豬精子形態(tài)正常率、頭部質(zhì)膜完整率及尾部質(zhì)膜完整率均顯著低于對(duì)照組新鮮精子,SOD活性顯著降低,MDA含量顯著增加,冷凍—解凍造成了精子膜損傷,該結(jié)果與任俊玲等研究結(jié)果一致。精子經(jīng)歷超低溫保存時(shí),冰晶的形成和滲透壓改變致使精子膜損傷,對(duì)ROS水平變化的敏感性增加,進(jìn)而導(dǎo)致精子膜含有的不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),產(chǎn)生大量脂類(lèi)過(guò)氧化物及新的氧自由基,造成精子膜發(fā)生不可逆損傷。維生素C具有較強(qiáng)的還原性,可有效清除氧自由基毒性。試驗(yàn)結(jié)果表明,冷凍2組(冷凍1組中添加0.05%維生素C)各指標(biāo)雖與對(duì)照組存在顯著差異,但解凍后豬精子形態(tài)正常率、頭部質(zhì)膜完整率