不同提取方法提取水稻葉片總蛋白的比較

不同提取方法提取水稻葉片總蛋白的比較

1975年，o'farrils提出的雙向沉淀電泳技術(shù)（2-de）是蛋白質(zhì)組學(xué)中廣泛使用的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。其基本原則是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pi）和含量（mw）的大小，將其分離兩次不同方向的電離作用，具有較高的分辨率和良好的重復(fù)性。蛋白質(zhì)的提取是雙向電泳中非常關(guān)鍵的一步,針對(duì)不同的研究目的選擇適合的蛋白提取方法可以獲得滿意的二維電泳圖譜。植物組織樣品由于富含色素、酚、脂類、多糖等干擾物質(zhì),因而較難獲得提純的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有的用于植物組織雙向電泳總蛋白提取方法主要包括三氯乙酸(trichlomaceticacid,TCA)/丙酮沉淀法、傳統(tǒng)的酚法、十二烷基硫酸鈉(SDS)法和鎂/乙基苯基聚乙二醇(Mg/NP-40)提取法等。其中,在植物蛋白質(zhì)組學(xué)尤其是在水稻蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的蛋白提取方法是TCA/丙酮沉淀法。水稻(Oryzasativa)是一種重要的糧食作物,它因?yàn)榛蚪M較小、分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)而作為單子葉植物遺傳和分子生物學(xué)研究的模式植物。隨著水稻全基因組測(cè)序的完成,水稻蛋白質(zhì)組的研究越來(lái)越被人們所重視。在使用雙向電泳技術(shù)檢測(cè)時(shí),常由于高豐度蛋白的干擾而造成低豐度蛋白很難被檢測(cè)到。在植物葉片中,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-BisphosphateCarboxylase/Oxygenase,RuBisCO)是可溶性蛋白中含量最高的蛋白質(zhì),大約占50%,由于它豐度極高,在使用雙向電泳技術(shù)分離植物蛋白質(zhì)組時(shí)常會(huì)使一些低豐度蛋白難以被檢測(cè)到,給蛋白質(zhì)組學(xué)分析造成一定困難。S.TaeKim等人用改進(jìn)的Mg/NP-40提取法獲得的水稻葉片總蛋白能夠有效地減少分離蛋白中RuBisCO蛋白的含量,使雙向電泳分析可以識(shí)別更多的低豐度蛋白。然而,TCA/丙酮沉淀法和Mg/NP-40提取法所獲得的水稻葉片總蛋白在雙向圖譜中分布的具體情況,至今還無(wú)人報(bào)道。本研究采用TCA/丙酮沉淀法和Mg/NP-40提取法分別提取水稻苗期葉片的總蛋白,應(yīng)用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行分離分析,確定了這兩種水稻葉片總蛋白提取方法在雙向圖譜中的分布特征。1材料和方法1.1水稻葉片總蛋白的提取采用水稻粳稻品種松粳6號(hào)(由五常種子公司提供),在實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)架培養(yǎng)(3000lux,25℃±2,光照16h/d)3周后用于提取水稻葉片總蛋白。1.2水稻葉片的提取(1)TCA/丙酮沉淀法:取1.5g水稻葉片在液氮中充分研磨至粉末狀,并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中;加入9mL-20℃預(yù)冷的蛋白提取液Ⅰ(含0.07%β-巰基乙醇的10%三氯乙酸丙酮溶液)。充分混合后-20℃靜置至少1h。4℃,15000r/min離心10min。棄上清。沉淀重懸浮于9mL-20℃預(yù)冷蛋白提取液Ⅱ(含0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液)中,-20℃放置1h。4℃,15000r/min離心10min,棄上清。重復(fù)清洗一次。沉淀重懸于9mL-20℃預(yù)冷的蛋白提取液III(含0.07%β-巰基乙醇的80%丙酮溶液)中,-20℃中靜置1h。4℃,15000r/min離心10min,棄上清。將沉淀真空干燥后,研磨成粉末狀,-80℃保存?zhèn)溆谩?2)Mg/NP-40提取法:取1.5g水稻葉片在液氮中充分研磨至粉末狀,并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中;加入10mL預(yù)冷的Mg/NP-40提取緩沖液(0.5MTris-HCl,pH值8.3,2%NP-40、20mMMgCl2、2%β-巰基乙醇、1mMPMSF、1%PVP),冰上放置30min。4℃,12000r/min離心15min。取上清,加入50mL-20℃預(yù)冷的丙酮,-20℃靜置1h。4℃,3000r/min離心10min。棄上清,將沉淀真空干燥后,-80℃保存?zhèn)溆谩?.3蛋白凝膠凝膠電泳用300μL水化上樣緩沖液(8M尿素、4%CHAPS、6mMDTT、0.2%w/vBio-Lyte)溶解30mg蛋白粉。37℃水浴30min。4℃,12000r/min離心30s,取上清。Bradford法測(cè)定蛋白濃度。雙向電泳采用Bio-Rad公司電泳系統(tǒng),參照文獻(xiàn)和Bio-Rad操作指南進(jìn)行。IPG膠條為17cm(pH值4.0～7.0;Bio-Rad),第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳膠濃度為13%。染色采用銀染。用普通凝膠成像系統(tǒng)(UVP)采集圖像。每種蛋白提取方法的雙向電泳進(jìn)行三次重復(fù)。1.4圖像統(tǒng)計(jì)分析采用ImageMaster圖像分析軟件(Amersham)對(duì)圖像進(jìn)行分析。編寫工作組群,調(diào)整圖像灰度使所有蛋白點(diǎn)都清晰可見,蛋白點(diǎn)檢測(cè)時(shí)選取相同參數(shù)(smooth:4,MinArea:28,Saliency:1.5)。2可以有效識(shí)別低豐度蛋白點(diǎn)的比較2.1兩種提取方法蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較采用雙向電泳檢測(cè)手段比較兩種不同方法所獲得的蛋白質(zhì)(圖1)。采用ImageMaster圖像分析軟件分析雙向電泳圖譜。TCA/丙酮沉淀法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)為1019個(gè)(圖1a),Mg/NP-40提取法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)為1317個(gè)(圖1b)。圖1a有一條明顯的橫條紋,分子量大約為53kD。本實(shí)驗(yàn)室前期質(zhì)譜鑒定指出圖1a圓圈標(biāo)示的蛋白點(diǎn)是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-BisphosphateCarboxylase/Oxygenase,RuBisCO)大亞基。用Mg/NP-40提取法獲得的蛋白質(zhì),在53kD處沒有那條橫條紋,RuBisCO大亞基蛋白點(diǎn)幾乎看不見(圖1b),使更多的低豐度蛋白點(diǎn)可以被識(shí)別。2.3對(duì)不同等電點(diǎn)的蛋白分離效果的比較按照等電點(diǎn)的差異,將軟件檢測(cè)到的所有蛋白點(diǎn)進(jìn)行歸類(圖2)。兩種不同總蛋白提取方法所獲得的蛋白質(zhì),在雙向圖譜中分離的等電點(diǎn)范圍有差異。在pI為4～5范圍內(nèi),TCA/丙酮沉淀法分離的蛋白有211個(gè)可被檢測(cè),但Mg/NP-40提取法分離的pI為4～5蛋白只有184個(gè)。在分離pI為5～6的蛋白和pI為6～7的蛋白時(shí),Mg/NP-40提取法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)分別為701個(gè)、432個(gè),高于TCA/丙酮沉淀法(495個(gè)、313個(gè))。將軟件檢測(cè)到的所有蛋白點(diǎn)按照在不同等電點(diǎn)區(qū)域蛋白點(diǎn)數(shù)百分比進(jìn)行分析(圖3)。結(jié)果顯示,在分離pI為4～5的蛋白時(shí),TCA/丙酮沉淀法分離百分比為20.7%,明顯高于Mg/NP-40提取法(14.0%)。在分離pI為5～6的蛋白和pI為6～7的蛋白時(shí),Mg/NP-40提取法分離百分比分別為32.8%,53.2%,高于TCA/丙酮沉淀法(30.7%、48.6%)。2.3對(duì)不同分子量的蛋白分離效果的比較按照分子量,可以將圖1所檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)分為6組(圖4),在分子量為31～43kD和43～67kD范圍內(nèi),TCA/丙酮沉淀法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)分別為303個(gè)、367個(gè),高于Mg/NP-40提取法(287個(gè)、325個(gè))。在分子量為14～20kD和高于67kD范圍內(nèi),Mg/NP-40提取法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)分別為270個(gè)、116個(gè),高于TCA/丙酮沉淀法(86個(gè)、28個(gè))。在分子量小于14kD和20～31kD范圍內(nèi),兩者分離能力相似。將軟件檢測(cè)到的所有蛋白點(diǎn)按照不同分子量區(qū)域內(nèi)蛋白點(diǎn)數(shù)百分比進(jìn)行分析(圖5),結(jié)果顯示,在分子量為31～43kD和43～67kD范圍內(nèi),TCA/丙酮沉淀法分離百分比分別為29.72%、36.02%,明顯高于Mg/NP-40提取法(21.79%、24.68%)。在分子量為14～20kD和高于67kD范圍內(nèi),Mg/NP-40提取法分離百分比分別為20.44%、8.87%,明顯高于TCA/丙酮沉淀法(8.44%、2.75%)。在分子量小于14kD和20～31kD范圍內(nèi),兩者分離能力相似,TCA/丙酮沉淀法分離百分比分別為1.28%、21.79%,Mg/NP-40提取法分離百分比分別為1.82%、22.40%。3中心、范圍內(nèi)雙向電泳分離蛋白的比較經(jīng)過(guò)對(duì)兩種不同總蛋白提取方法的比較,Mg/NP-40提取法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)(1317個(gè))要略微高于TCA/丙酮沉淀法(1019個(gè))。從圖1中可以看出,相對(duì)于TCA/丙酮沉淀法,Mg/NP-40提取法可以有效地減少水稻葉片中RuBisCO大亞基,提高水稻葉片蛋白質(zhì)組檢測(cè)水平,使得一些低豐度蛋白可以被檢測(cè)到。這一結(jié)果與S.TaeKim相一致。RuBisCO是光合碳同化作用的關(guān)鍵酶,也是光合作用的限速酶。在植物葉片中,RuBisCO是可溶性蛋白中含量最高的蛋白質(zhì),是植物體內(nèi)一種重要的儲(chǔ)藏蛋白。RuBisCO的存在干擾了低豐度蛋白的檢測(cè)。而在生物體內(nèi),低豐度蛋白質(zhì)往往是執(zhí)行重要生物功能的蛋白質(zhì),如調(diào)控蛋白,受體蛋白等。因此,檢測(cè)低豐度蛋白對(duì)于植物蛋白質(zhì)組學(xué)是非常重要的。在對(duì)不同等電點(diǎn)的蛋白分離效果的比較上,TCA/丙酮沉淀法更適于分離等電點(diǎn)在4～5范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),其分離蛋白點(diǎn)數(shù)和分離百分率都要高于Mg/NP-40提取法。其中,將兩種方法分離的百分率相比較,TCA/丙酮沉淀法高出6.7%。而對(duì)于等電點(diǎn)在5～7范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),更適于采用Mg/NP-40提取法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。在等電點(diǎn)6～7范圍內(nèi),Mg/NP-40提取法分離百分率略高于TCA/丙酮沉淀法。在等電點(diǎn)5～6范圍內(nèi),Mg/NP-40提取法分離百分率高出TCA/丙酮沉淀法4.6%。在對(duì)不同分子量的蛋白分離效果的比較上,TCA/丙酮沉淀法更適合分離分子量為31～67kD范圍內(nèi)的蛋白。在分離分子量為31～43kD范圍內(nèi)的蛋白時(shí),兩種方法分離百分率相差7.93%。在分離分子量為43～67kD范圍內(nèi)的蛋白時(shí),兩種方法分離百分率相差11.34%。雖然后者明顯高于前者,但是,在分子量為43～67kD范圍內(nèi)存在著大量的RuBisCO大亞基及其大亞基前體蛋白,高豐度的RuBisCO大亞基干擾了低豐度蛋白的檢測(cè)。Mg/NP-40提取法分離蛋白百分率比TCA/丙酮沉淀法要低,但是由于它有效的減少了RuBisCO蛋白,使得一些低豐度蛋白能夠被檢測(cè)到,更適合用來(lái)分析低豐度蛋白的變化。如果想要檢測(cè)盡可能多的蛋白點(diǎn)或者是RuBisCO蛋白,采用TCA/丙酮沉淀法更適合。Mg/NP-40提取法更適合分離分子量為14～20kD和大于67kD范圍內(nèi)的蛋白。在分離分子量為14～20kD范圍內(nèi)的蛋白時(shí),Mg/NP-40提取法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)比TCA/丙酮沉淀法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)多出184個(gè),分離百分比差值為12%。在分離分子量大于67kD范圍內(nèi)的蛋白時(shí),Mg/NP-40提取法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)比TCA/丙酮沉淀法可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)多出88個(gè),分離百分比差值為6.12%。結(jié)果顯示,Mg/NP-40提取法更適合分離分子量在14～20kD范圍內(nèi)的蛋白。在分離