淺談基于無菌外植體的西蘭花組培苗生產(chǎn)技術(shù)

淺談基于無菌外植體的西蘭花組培苗生產(chǎn)技術(shù)

20世紀70年代以后，隨著蘭花組織培養(yǎng)技術(shù)的成熟和完善，蘭組織培養(yǎng)研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用進入了快速發(fā)展階段。目前，我國蘭花育苗和溫室苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展日益規(guī)模，快速發(fā)展的企業(yè)應(yīng)用也在全國各省市蓬勃發(fā)展。雖然蘭花組織快繁技術(shù)已成熟,但在組培過程中常會出現(xiàn)許多問題,迫切需要解決。現(xiàn)就從臺灣引進的蘭花品種(蝴蝶蘭、大花惠蘭、文心蘭、卡特蘭、石斛蘭等)在組培苗生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的褐化、黃化、污染、材料死亡等問題的原因歸納如下,并提出解決方法。1外植體材料和育種材料的褐色1.1外植體培養(yǎng)1.1.1品種(如:M811、M802、M8124、M8126等)。不同的蘭花品種之間常有很大差異,一般來說,外植體材料中單寧類和多種羥酚類化合物含量高的品種易引起褐化。1.1.2外植體年齡。通常是幼嫩部位產(chǎn)生褐化較輕,隨著組織的老齡化而褐化加重。1.1.3外植體取樣時間和取材部位。一般在春夏季,尤其是在春季采取生長旺盛部位作外植體較好。1.1.4培養(yǎng)基成分。在初級培養(yǎng)階段,選擇適宜的無機鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度對防止褐化也能起到較好的作用。1.1.5外植體大小及受傷害程度。外植體組織受傷害程度直接影響褐變。在切取易褐變的蘭花外植體時,應(yīng)盡可能減小傷口面積,傷口剪切要盡可能平整;同時還要考慮外植體的粗、細度,材料切取以細短,粗長為原則。1.1.6環(huán)境pH。試驗表明,pH5.5時的成活率明顯比pH4.6~5.0時高。因此,在培養(yǎng)時培養(yǎng)基應(yīng)保持較高的pH。1.1.7溫度和光照。在培養(yǎng)初期,較高的溫度和光照對易產(chǎn)生褐化的蘭花培養(yǎng)不利。1.1.8培養(yǎng)方式。培養(yǎng)方式包括外植體在培養(yǎng)基中的放置方式和材料轉(zhuǎn)瓶周期、材料接種密度等。1.1.9外植體表面消毒劑種類及使用濃度和消毒時間。1.2外植體消毒處理的使用方法1.2.1采用適宜的外植體。在切取外植體之前對母株或枝條進行遮光處理20d左右,或把母株置于溫室內(nèi)培養(yǎng),不要噴水(噴水易感染病菌)。因為酶在自然光照條件下生長的植物體內(nèi)非?；钴S,從這樣的植株上取得外植體很容易發(fā)生褐變,而把取材母株設(shè)置在黑暗或弱光條件下生長,植株組織內(nèi)光誘導(dǎo)的那些參與酚類合成的氧化酶活性就大大減弱,以致酚類化合物的合成減少,其氧化產(chǎn)物醌類也相應(yīng)減少,使褐變得到控制。1.2.2使用適宜的無機鹽成分、蔗糖濃度(1%~2%)、激素水平、溫度及在黑暗條件下培養(yǎng)可以減輕材料的褐化。1.2.3對那些褐化嚴重的品種,如M811、M802、M8124、M8126,最好在培養(yǎng)基中加入適量抗氧化劑和一些抑制劑,如:維生素C、檸檬酸、半胱氨酸鹽酸鹽、谷胱甘肽和巰基乙酸、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、硫脲、二氨基二硫代甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、氰化鉀、二硫蘇糖醇多氨等,具體加入那種抗氧化劑和抑制劑視品種而定。1.2.4盡可能減少新鮮外植體材料切割、接種操作過程中在空氣中暴露的時間,以減輕外植體的褐化。1.2.5降低環(huán)境的pH。因為多酚氧化酶的活性在pH6.5時最大,隨著pH的降低活性下降。在培養(yǎng)基中適量加入維生素C或檸檬酸等還原劑,也能降低pH,但不能低于5.5,因為培養(yǎng)基在pH5.2~5.8范圍內(nèi)蘭花都能正常生長,以pH5.5為宜,所以加入還原劑在降低pH的同時,也能降低多酚氧化酶的活性,從而減輕材料的褐化。1.2.6對褐化嚴重的蘭花品種,將材料反復(fù)轉(zhuǎn)移(或連續(xù)轉(zhuǎn)移)到新培養(yǎng)基上和在培養(yǎng)基中加入吸附劑活性炭(0.1%~2.5%)或5~20g/L的PVP或加倍Fe-EDTA(螯合鐵)的用量,具體加入那種成分視品種而定。在使用吸附劑吸附蘭花有毒酚類的同時,也會吸附培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑,因此在添加有活性炭的培養(yǎng)基中,生長調(diào)節(jié)劑的濃度也應(yīng)適當提高,以利芽球分化。1.2.7使用適當?shù)耐庵搀w消毒劑種類、濃度和處理時間。常用消毒劑有氯化汞和次氯酸鈉,但氯化汞易引起褐化,次氯酸鈉次之,其濃度與褐化程度呈正相關(guān)。處理時間越長,消毒效果越好,但褐化也越嚴重,因而要正確選擇消毒劑濃度及消毒時間,才能保證較高的外植體存活率。1.2.8對褐化嚴重的蘭花可適當降低培養(yǎng)溫度,以15~25℃為宜,在此溫度下培養(yǎng)7~14d。不能長期低溫培養(yǎng),長期低溫培養(yǎng)雖然可以減少褐化現(xiàn)象,但是組培苗存活率低,分化率亦低。1.2.9大部分蘭花品種對光照極為敏感,光照強芽球和苗生長粗壯,葉色綠、厚,質(zhì)量好,但對褐化嚴重的品種的初級培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)極為不利,因此對此類品種,在誘導(dǎo)外植體的初級培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)階段應(yīng)先在200~500lx的光照強度下培養(yǎng)7~14d,然后逐漸增加到1500~2000lx光照培養(yǎng)。2黃苗的問題2.1培養(yǎng)基育人環(huán)境氣溶膠菌培養(yǎng)是將土地光或水引起黃化的主要原因是培養(yǎng)基中Fe含量不足,各種礦物質(zhì)營養(yǎng)不均衡,培養(yǎng)環(huán)境通氣不良,瓶內(nèi)乙烯含量增高,激素配比不當,糖用量不足或長時間不轉(zhuǎn)移,培養(yǎng)基內(nèi)的糖已耗盡,pH變化過大,培養(yǎng)溫度不適(時高時低),光照不足,材料污染(特別是被細菌污染)等。2.2改善通氣狀況首先檢查母液配制是否正確,及時轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物(材料),降低密度,使用透氣的棉花塞或透氣的封口紙(或膜)來改善瓶內(nèi)通氣狀況,去除污染,控制培養(yǎng)溫度,適當增加光照,適當調(diào)節(jié)pH、激素配比和無機鹽濃度。另外,在培養(yǎng)基中加有抗生素的蘭花組培苗有時也會出現(xiàn)幼苗黃化現(xiàn)象,如果黃化嚴重,應(yīng)適當減少用量或停止使用。3污染3.1組培中細菌污染情況微生物(細菌、霉菌、病毒)污染是研究工作者感到最棘手的問題,也是影響蘭花組培苗成敗的重要指標之一。在蘭花組培過程中,細菌污染率高于霉菌污染率,占總污染率80%以上。細菌污染又分為外生細菌、內(nèi)生細菌的污染,外生細菌污染多數(shù)是培養(yǎng)基、外植體接種、母瓶材料、接種工具、接種員工違反操作規(guī)程而引起,有人認為在組培中較常見的細菌性潛在污染可能是由器具消毒不徹底,帶有半致死性細菌引起。而內(nèi)生細菌污染情況比較復(fù)雜,可能是外植體材料本身攜帶,所以選擇適宜的外植體材料常常是生產(chǎn)蘭花組培苗成敗的關(guān)鍵。3.2加強接種前準備工作3.2.1定期對培養(yǎng)器皿和接種工具進行高壓滅菌消毒。消毒出鍋后的接種紙最好放入烘箱烘干水分后2d內(nèi)用完,刀、剪、鑷子等金屬用具,在每次操作(接種)開始前需要在75%酒精中浸泡5~10min,再在酒精燈的火焰上灼燒消毒或在帶有石英砂的消毒器內(nèi)高溫消毒5~10min,冷卻后使用。在接種期間接完一瓶母瓶材料,器具消毒一次。切割完一瓶母種材料后及時更換無菌紙,以免材料間交叉污染。定期檢查無菌紙是否有破損如洞眼、破裂等,對已破損的無菌紙及時更換。3.2.2定期檢查超凈工作臺污染情況。檢查方法是將真細菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿數(shù)個,放在臺面不同部位,開啟超凈工作臺5~10min后將皿蓋打開,放置30min,然后蓋上培養(yǎng)皿,用透明膠將培養(yǎng)皿封好,放入35℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)3~7d,如果無細菌和霉菌生長即表明無菌效果良好。3.2.3定期用高錳酸鉀和甲醛薰蒸接種室,使用濃度按常規(guī)。做好培養(yǎng)環(huán)境管理,定期(一個月)開臭氧發(fā)生器對培養(yǎng)室滅菌消毒一次,消毒時間1~2h。接種前,無菌室用紫外燈照射消毒30min以上,并開超凈工作臺紫外燈照射消毒15~20min,然后啟動超凈工作臺,吹風10~15min后使用。接種完畢后塞緊內(nèi)瓶蓋,及時蓋上外套(塑料套),避免內(nèi)瓶蓋上的棉花滋生霉菌。3.2.4檢查和監(jiān)督接種員工遵守接種操作規(guī)章,避免接種工具碰到污染物,造成不必要的交叉污染。專人專門負責檢查母瓶材料是否有細菌、霉菌感染,對已污染的母瓶材料及時進行處理和淘汰。3.3外植體接種程序3.3.1從室內(nèi)盆栽蘭花中選取潔凈、無病蟲害、比較細嫩、生長能力較強部位且經(jīng)多次接種易獲得無菌材料的蘭花作為外植體,將接種的外植體嚴格按照獲取無菌外植體的基本操作程序和外植體滅菌操作程序?qū)ζ溥M行接種。3.3.2正確選用表面消毒劑、消毒濃度和消毒時間。一瓶培養(yǎng)管放入一塊材料,避免互相污染。對滅菌接種在半個月以上仍未污染,且已成活的滅菌外植體要及時轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi),每2~3d觀察細菌、霉菌污染情況,及時消除污染試管。3.3.3在培養(yǎng)基內(nèi)加入適量經(jīng)過濾殺菌后的抗生素。4組培苗的飼養(yǎng)管理培養(yǎng)材料死亡在各個階段都可能發(fā)生,尤其在增殖階段中材料大量死亡,會導(dǎo)致增殖材料減少,損失慘重,因此在蘭花組培過程中要加以重視。4.1避免材料死亡的方法4.1.1在初級培養(yǎng)階段,外植體選用比較溫和的滅菌劑,降低藥劑濃度,減少消毒時間,選擇在生長季節(jié)取芽。4.1.2根據(jù)不同的蘭花品種準確配制各種激素、母液培養(yǎng)基,選用含鹽量較低的培養(yǎng)基,也可試用1/2或1/4培養(yǎng)基,并調(diào)整各