蔬菜葉片中葉綠體提取與鑒定

蔬菜葉片中葉綠體提取與鑒定

葉片綠體dna（ctsda）的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)提高作物的外觀和光合效率具有重要意義，有助于研究細(xì)胞。自20世紀(jì)70年代Kolndener和Towari首先成功提取了豌豆ctDNA以來,ctDNA的研究開始受到廣泛注意,已對(duì)多種豆科、禾木科植物等進(jìn)行了研究,提供了許多從不同植物中提取ctDNA的方法。由于綠色蔬菜的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)一般比較肥大、脆弱、含有較多汁液、豐富的糖類、酸類、堿類及酚類等物質(zhì),所以分離其葉綠體DNA時(shí),在破碎細(xì)胞的過程中容易受到核DNA、線粒體DNA及一些酚類等物質(zhì)的污染和影響,從而使前人方法的應(yīng)用受到一定制約和一些條件限制。本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上通過改進(jìn)差速離心與密度梯度離心,選用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)試劑提取,為從綠葉蔬菜中提取ctDNA提供了一種可供參考的方法。1材料和方法1.1dy-型電泳法供試材料為新鮮蔬菜,菠菜、韭菜葉片,購于陜西省楊凌示范區(qū)市場(chǎng)。儀器有日立SCR20BC高速離心機(jī),日立55P-72超速離心機(jī),BeckmanUV-7紫外分光光度計(jì),DYY-Ⅲ型電泳儀。試劑為A液:0.3mol/L蔗糖,50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTA,5mmol/L巰基乙醇,0.1%BSA,1.0%PVP,10mmol/LMgCl2。B液:0.3mol/L蔗糖,50mmol/LTris-HClpH8.0,3mmol/LEDTA,5mmol/LMgCl2。C液:50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTA。1.2葉綠體dna的純化葉綠體的提取分離取新鮮蔬菜葉片200g洗凈,暗處理48h,加入2.5倍體積緩沖勻漿液A,于組織搗碎機(jī)內(nèi)勻漿5次,每次10s,用4層紗布過濾,收集濾液,4℃下300×g離心2min,收集上清,1500×g離心10min,取沉淀。用B液懸浮。將以上過程重復(fù)1次。葉綠體純化制備參考張志良,印莉萍等的方法,按階梯型密度梯度在離心管中按至下而上的順序鋪上2mol、1.8mol、1.5mol、0.8mol四層蔗糖溶液,在梯度項(xiàng)端加上3~5mL葉綠體粗提取液。4℃下30000×g離心50min。在1.8mol與1.5mol的界面間,出現(xiàn)一個(gè)明顯的綠色區(qū)帶(圖1)。用帶直角彎針頭的注射器從葉綠體區(qū)帶中慢慢地將葉綠體區(qū)帶吸出(即純化的葉綠體)。加B液洗滌,1500×g離心10min,除去蔗糖。沉淀為純制劑懸浮于10mLB液。取一小部分用于鏡檢的樣懸浮于B液(4℃下存放),顯微觀察(圖2)。葉綠體DNA的提取純化參考T.Manitis,岳強(qiáng)等的方法,用50μg/mLDNaseⅠ處理葉綠體懸液,37℃1h,加入EDTA使終濃度為20mmol/L,除核DNA的污染。用酚/氯仿(1∶1)5000r/min抽提一次,吸取水相。加入10%SDS使終濃度為2%,加入蛋白酶K至50μg/mL,于37℃水浴保溫2h。加入等體積的酚,在三角瓶中輕輕旋轉(zhuǎn)15min,5000r/min離心5min,吸取水相加入等體積的酚/氯仿(1∶1)混合15min后5000r/min離心5min。加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)搖動(dòng)10min后,5000r/min離心5min。吸取上層水相。重復(fù)此步驟直至中層無變性蛋白質(zhì)。加等體積水飽和乙醚反應(yīng)5s,8000×g離心3min,吸取上層乙醚后置65℃水浴10min,除乙醚。取水相,加MgCl2到10mmol/L和1/10倍體積3mol/LNaOAC后,再加入兩倍體積冷乙醇,置-20℃冰箱過夜。5000r/min離心10min后,將沉淀溶于少量C液中加入固體NaCl使終濃度為50mg/mL,于-20℃放置1h后,10000×g離心5min,收集上清。加入RNase使終濃度為50μg/mL,37℃水浴保溫1h。重復(fù)酚、氯仿/異戊醇脫蛋白步驟,收集上清液。加入MgCl2到15mmol/L和1/10倍體積3mol/LNaOAC,再加入兩倍體積冷乙醇,置-20℃冰箱過夜,15000r/min離心30min,收集沉淀1mL75%乙醇中-20℃保存。1.3ctcda濃度與純度按常規(guī)方法用紫外分光光度計(jì)定容測(cè)定ctDNA在260nm和280nm處吸光度值(表1)。計(jì)算ctDNA濃度與純度。取5μL所得ctDNA溶液,用1%瓊脂糖電泳,0.5×TAE緩沖液,80V下電泳45min,紫外光觀察并照相(圖3)。2結(jié)果與分析2.1葉綠體層的劃分從圖1可見,離心管內(nèi)梯度中可看到4條明顯區(qū)帶,頂層區(qū)帶L為脂質(zhì)層,中層上部D為破碎葉綠體,中層下部C為葉綠體層,下層區(qū)帶P為質(zhì)體層;其他為密度高的淀粉粒,細(xì)胞雜質(zhì)沉淀到離心管底部。其中葉綠體層數(shù)量比較多,但中上部仍存在較多破碎葉綠體。葉綠體與細(xì)胞碎片和雜質(zhì)得到良好分離(圖1)。2.2光學(xué)顯微鏡下的觀察純化后葉綠體為橢圓或卵形,無細(xì)胞碎片和其他細(xì)胞器(圖2)。圖2放大倍數(shù)為16×100(油鏡觀察)、×8倍尼康數(shù)碼照相機(jī)照相。2.3紫外分光光度計(jì)tcdaA260估算DNA提取量約200~300μg/200gctDNA純度按A260/A280值接近1.8(表1)。2.4葉綠體dna提取用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取出來的ctDNA,得到清晰整齊的條帶(圖3、4)。3dna提取高等植物中一般綠色蔬菜葉片細(xì)胞含有較多汁液,結(jié)構(gòu)比較脆弱,如果需要的材料數(shù)量較多適宜選用組織搗碎法。一般細(xì)胞核沉降系數(shù)為7×106s左右,密度為1.3g/cm3。線粒體沉降系數(shù)S值為1~1.7×104s,密度1.18~1.19g/cm3。而葉綠體密度為1.21g/cm3,S值3×105。質(zhì)體密度1.22g/cm3。據(jù)此正確地選擇離心力,選用2~3循環(huán)差速離心,結(jié)合2mol、1.8mol、1.5mol、0.8mol蔗糖密度梯度離心,就可較好地除去細(xì)胞核nDNA、線粒體以及細(xì)胞碎片和破碎細(xì)胞的膜類、線粒體等,獲得純度較高的葉綠體。而這正是獲得的純度較高的ctDNA的關(guān)鍵之一。在葉綠體懸浮液中使用DNaseⅠ,用以除去nDNA及mtDNA污染。在ctDNA懸液中使用RNase,水解殘存的RNA。使用過這些酶制劑后應(yīng)該對(duì)其及時(shí)做滅活、清除處理。葉綠體通過化學(xué)破膜蛋白酶處理后,使用蛋白酶K降解變性蛋白;酚與氯仿有機(jī)溶劑除蛋白質(zhì),一般需重復(fù)3~5次以上,直至有機(jī)相與水相之間無變性蛋白。以保證樣品純度。大多數(shù)高等植物葉綠體DNA長(zhǎng)度為120~180kb左右。為了保證獲取DNA的效率,使用乙醇沉淀前最好使溶液中MgCl2濃度達(dá)