轉基因植物安全評價指南

1轉基因植物安全評價指南〔試行〕農業(yè)部農業(yè)轉基因生物安全治理辦公室2023年9月10目 錄前 言 3\l“_TOC_250027“一、總體要求 4\l“_TOC_250026“〔一〕分子特征 4\l“_TOC_250025“表達載體相關資料 4\l“_TOC_250024“目的基因在植物基因組中的整合狀況 5\l“_TOC_250023“外源插入片段的表達狀況 6\l“_TOC_250022“〔二〕遺傳穩(wěn)定性 7\l“_TOC_250021“目的基因整合的穩(wěn)定性 7\l“_TOC_250020“目的基因表達的穩(wěn)定性 7\l“_TOC_250019“目標性狀表現的穩(wěn)定性 7\l“_TOC_250018“〔三〕環(huán)境安全 7\l“_TOC_250017“生存競爭力量 7\l“_TOC_250016“基因漂移的環(huán)境影響 8\l“_TOC_250015“轉基因植物的功能效率評價 8\l“_TOC_250014“有害生物抗性轉基因植物對非靶標生物的影響 9對植物生態(tài)系統(tǒng)群落構造和有害生物地位演化的影響 9\l“_TOC_250013“靶標生物的抗性風險 9\l“_TOC_250012“〔四〕食用安全 10\l“_TOC_250011“表達物質毒理學評價 10\l“_TOC_250010“致敏性評價 11\l“_TOC_250009“關鍵成分分析 12\l“_TOC_250008“全食品安全性評價 13\l“_TOC_250007“養(yǎng)分學評價 13\l“_TOC_250006“生產加工對安全性影響的評價 13\l“_TOC_250005“按個案分析的原則需要進展的其它安全性評價 14\l“_TOC_250004“二、階段要求 14\l“_TOC_250003“〔一〕申請中間試驗 14\l“_TOC_250002“〔二〕申請環(huán)境釋放 15\l“_TOC_250001“〔三〕申請生產性試驗 16\l“_TOC_250000“〔四〕申請安全證書 17前前言為標準轉基因植物安全評價工作，推動我國轉基因生物爭論與產業(yè)化安康進展，依據《農業(yè)轉基因生物安全評價治理方法》要求，在總結我國轉基因生物安全評價多年實踐閱歷以及局部借鑒國外轉基因生物安全評價方法根底上，組織國家農業(yè)轉基因生物安全委員會，制定了《轉基因植物安全評價指南〔試行審。本指南是一個技術性指導文件，是在現有法規(guī)框架內細化了轉基因植物安全評價資料要求，增加了法規(guī)的可操作性。指南由總體要求、階段要求兩局部組成。總體要求從轉基因植物分子特征、遺傳穩(wěn)定性、環(huán)境安全和食用安全等四個方面分別描述評價指標和資料要求。階段要求是在總體要求的根底上，進一步明確轉基因植物中間試驗、環(huán)境釋放、生產性試驗和申請安全證書各階段安全評價的根本要求。由于轉基因生物本身特性和生物技術飛速進展，很難以一個評價指南囊括全部狀況。本指南是轉基因植物安全評價的一般性資料要求。針對某一具體轉基因植物的安全評價，應當實行個案分析的原則，具體問題具體分析。轉基因植物安全評價指南〔試行〕一、總體要求〔一〕分子特征從基因水平、轉錄水平和翻譯水平，考察外源插入片段的整合和表達狀況。表達載體相關資料目的基因與載體構建的物理圖譜具體注明表達載體全部元件名稱、位臵和酶切位點。目的基因具體描述目的基因的供體生物、構造〔包括基因中的酶切位點、功能和安全性。Btcry1A來源于蘇云金芽孢桿菌XX菌株。DNA序列和推導的氨基酸序列。功能：生物學性狀，如抗鱗翅目昆蟲。安全性：從供體生物特性、安全使用歷史、基因構造、功能及有關安全性試驗數據等方面綜合評價目的基因的安全性。表達載體其他主要元件DNA序列〔或文獻、功能、安全應用記錄。DNA序列〔或文獻、功能、安全應用記錄。標記基因：供體生物來源、大小、DNA序列〔或文獻、功能、安全應用記錄。報告基因：供體生物來源、大小、DNA序列〔或文獻、功能、安全應用記錄?！踩缛斯ず铣苫蚬w生物名稱、名稱、大小、DNA序列〔或文獻、功能、安全應用記錄。目的基因在植物基因組中的整合狀況承受PCR、Southern雜交等方法，分析外源插入片段在植物基因組中的整合狀況，包括目的基因和標記基因的拷貝數，標記基因、報告基因或其它調控序列刪除狀況，整合位點等。外源插入片段的PCR檢測：片段名稱、引物序列、擴增產物長度、PCR條件、擴增產物電泳圖譜〔含圖題、分子量標準、陰性比照、陽性比照、泳道標注。外源插入片段的Southern雜交：植物基因組總DNA限制性酶切，供給兩種以上能明確整合拷貝數的、具有特異性雜交條帶的限制性內切酶圖譜。文字描述至少包括探針序列位臵、內切酶名稱、特異性條帶的大小、圖題、分子量標準、陰性比照、陽性比照、泳道標注。DNA組的全長DNA序列和插入位點的兩端邊界序列。供給PCR驗證時相應引物名稱、序列及其擴增產物長度。外源插入片段的表達狀況轉錄水平表達〔RNA〕RT－PCRNorthern列〔如目的基因、標記基因等〕的轉錄表達狀況，包括表達的主要組織和器官〔如根、莖、葉、種子等。RT－PCRRT-PCR條件、擴增產物電泳圖譜〔含圖題、分子量標準、陰性比照、陽性比照、泳道標注。Northern雜交：探針序列位臵、特異性條帶的大小、Northern雜交條件、雜交圖譜〔含圖題、分子量標準、陰性比照、陽性比照、泳道標注。翻譯水平表達〔蛋白質〕承受ELISA或Western雜交等方法，分析主要插入序列〔如目的基因、標記基因等〕的蛋白質表達狀況，包括表達的主要組織和器官〔如根、莖、葉、種子等。ELISA檢測：描述定量檢測的具體方法，包括相關抗體、陰性比照、陽性比照、光密度測定結果、標準曲線等。WesternWestern雜交條件、雜交圖譜〔含圖題、分子量標準、陰性比照、陽性比照、泳道標注、樣品和陽性比照的加樣量。〔二〕遺傳穩(wěn)定性主要考察轉基因植物代際間目的基因整合與表達狀況。目的基因整合的穩(wěn)定性用Southern或PCR手段檢測目的基因在轉化體中的整合狀況，明確轉化體中目的基因的拷貝數以及在后代中的分別3代的試驗數據。目的基因表達的穩(wěn)定性Northern，RT-PCR,Western等手段供給目的基因在轉化體不同世代在轉錄〔RNA〕和〔或〕翻譯〔蛋白質〕水平表達的穩(wěn)定性〔包括不同發(fā)育階段和不同器官部位的表達狀況，供給不少于3代的試驗數據。目標性狀表現的穩(wěn)定性用適宜的觀看手段考察目標性狀在轉化體不同世代的表3代的試驗數據。〔三〕環(huán)境安全生存競爭力量供給在自然環(huán)境下，轉基因植物與受體關于種子活力、種子休眠特性、越冬越夏力量、抗病蟲力量、生長勢、生育期、產量、落粒性等適合度變化與雜草化風險評估等的試驗數據和結論。假設受體植物為多年生草類〔飼草、制種用的草坪草〕或目標性狀增加生存競爭力〔如抗旱、耐鹽等析的原則提出有針對性的補充資料。基因漂移的環(huán)境影響受體物種的相關資料假設存在可交配的野生近緣種，供給野生近緣種的地理分布范圍、發(fā)生頻率、生物學特性〔生育期、生長習性、開花期、生殖習性、種子及無性生殖器官的傳播途徑等〕以及與野生近緣種的親緣關系〔包括基因組類型、與栽培種的自然異交結實性〔%、雜種F1結實力量〕的資料。假設存在同一物種的可交配植物類型，需供給同一物種植物類型的分布及其危害狀況。外源基因漂移風險對于存在可交配的野生近緣種或存在同一物種可交配的植物類型，又無相關數據和資料的，可設計試驗評估外源基因漂移風險及可能造成的生態(tài)后果，如基因漂移頻率、外源基因在野生近緣種中表達狀況、目的基因是否轉變野生近緣種的生態(tài)適合度等。轉基因植物的功能效率評價供給自然條件下轉基因植物的功能效率評價報告。如為有害生物抗性轉基因植物，則需要供給對靶標生物的抗性效率試驗數據?？剐孕手缚褂泻ι镛D基因植物所產生的抗性物質對靶標生物綜合作用的結果，一般通過轉基因品種與受體品種在靶標生物數量變化、危害程度、植物長勢及產量等方面的差異進展評價?？共∠x轉基因植物需供給在室內和田間試驗條件下，轉基因植物對靶標生物的抗性生測報告、靶標生物在轉基因及受體品種田季節(jié)性發(fā)生危害狀況和種群動態(tài)的試驗數據與結論。有害生物抗性轉基因植物對非靶標生物的影響依據轉基因植物與外源基因表達蛋白特點和作用機制，有選擇地供給對相關非靶標植食性生物、有益生物〔如天敵昆蟲、資源昆蟲和傳粉昆蟲等、受保護的物種等其它非靶標生物潛在影響的評估報告。對植物生態(tài)系統(tǒng)群落構造和有害生物地位演化的影響依據轉基因植物與外源基因表達蛋白的特異性和作用機理，有選擇地供給對相關動物群落、植物群落和微生物群落構造和多樣性的影響，以及轉基因植物生態(tài)系統(tǒng)下病蟲害等有害生物地位演化的風險評估報告等。靶標生物的抗性風險靶標生物的抗性是指靶標生物由于連續(xù)多代取食轉基因植物，敏感個體被淘汰，抗性較強的個體存活、生殖、漸漸進展成高抗性種群的現象。抗病蟲害轉基因植物需供給對靶標生物的作用機制和特點等資料，轉基因植物商業(yè)化種植前靶標生物的敏感性基線數據，抗性風險評估依據和結論，擬實行的抗性監(jiān)測方案和治理措施等?！菜摹呈秤冒踩罁€案分析的原則，評價轉基因植物與非轉基因植物的相對安全性。傳統(tǒng)非轉基因比照物選擇：無性生殖的轉基因植物，以非轉基因植物親本為比照物；有性生殖的轉基因植物，以遺傳背景與轉基因植物有可比性的非轉基因植物為比照物。對照物與轉基因植物的種植環(huán)境〔時間和地點〕應具有可比性。表達物質毒理學評價表達蛋白資料供給表達蛋白質〔包括目標基因和標記基因所表達的蛋白質〕的分子和生化特征等信息，包括分子量、氨基酸序列、翻譯后的修飾、功能表達等資料。表達的產物假設為酶，應供給酶活性、酶活性影響因素〔如pH、溫度、離子強度、底物特異性、反響產物等。供給表達蛋白質與毒蛋白質和抗養(yǎng)分因子〔如蛋白酶抑制劑、植物凝集素等〕氨基酸序列相像性比較的資料。供給表達蛋白質熱穩(wěn)定性試驗資料，體外模擬胃液蛋白消化穩(wěn)定性試驗資料，必要時供給加工過程〔熱、加工方式〕對其影響的資料。假設用體外表達的蛋白質作為安全性評價的試驗材料，需供給體外表達蛋白質與植物中表達蛋白質等同性分析〔如分子量、蛋白測序、免疫原性、蛋白活性等〕的資料。表達蛋白毒理學試驗當表達蛋白質無安全食用歷史，安全性資料缺乏時，28天喂養(yǎng)試驗毒理學資料視該蛋白質在植物中的表達水平和人群可能攝入水平而定，必要時應進展免疫毒性檢測評價。假設不供給表達蛋白質的經28天喂養(yǎng)試驗資料，則應說明理由。表達非蛋白質物質的評價表達的物質為非蛋白質，如脂肪、碳水化合物、核酸、維生素及其它成分等，其毒理學評價可能包括毒物代謝動力/致癌性、生殖發(fā)育毒性等方面。具體需進展哪些毒理學試驗，實行個案分析的原則。攝入量估算應供給外源基因表達物質在植物可食部位的表達量，依據典型人群的食物消費量，估算人群最大可能攝入水平，包括同類轉基因植物總的攝入水平、攝入頻率等信息。進展攝入量評估時需考慮加工過程對轉基因表達物質含量的影響，并應供給表達蛋白質的測定方法。致敏性評價外源基因插入產生蛋白質，或轉變代謝途徑產生蛋白質的，應對其蛋白質的致敏性進展評價。供給基因供體是否含有致敏原、插入基因是否編碼致敏原、蛋白質在植物食用和飼用部位表達量的資料。供給表達蛋白質與致敏原氨基酸序列的同源性分析比較資料。供給表達蛋白質熱穩(wěn)定性試驗資料，體外模擬胃液蛋白消化穩(wěn)定性試驗資料。對于供體含有致敏原的，或蛋白質與致敏原具有序列同源性的，應供給與致敏原為抗體的血清學試驗資料。受體植物本身含有致敏原的，應供給致敏原成分含量分析的資料。關鍵成分分析供給受試物根本信息，包括名稱、來源、所轉基因和轉基因性狀、種植時間、地點和特異氣候條件、貯存條件等資玉米、棉籽、水稻種子等。同一種植地點至少三批不同種植時間的樣品，或三個不同種植地點的樣品。供給同一物種比照物各關鍵成分的自然變異閥值及文獻資料等。礦物質、維生素等，必要時供給蛋白質中氨基酸和脂肪中飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸含量分析的資料。礦物質和維生素的測定應選擇在該植物中具有顯著養(yǎng)分意義或對人群養(yǎng)分素攝入水平奉獻較大的礦物質和維生素進展測定。自然毒素及有害物質自然存在的有害物質，依據不同植物進展不同的毒素分析，如棉籽中棉酚、油菜籽中硫代葡萄糖甙和芥酸等?？桂B(yǎng)分因子。對養(yǎng)分素的吸取和利用有影響、對消化酶有抑制作用的一類物質。如大豆胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集素、大豆寡糖等；玉米中植酸；油菜籽中單寧等。其他成分。如水分、灰分、植物中的其他固有成分非預期成分。因轉入外源基因可能產生的成分。全食品安全性評價90和生殖毒性試驗及其他動物喂養(yǎng)試驗資料。養(yǎng)分學評價假設轉基因植物在養(yǎng)分、生理作用等方面有轉變的，應供給養(yǎng)分學評價資料。供給動物體內主要養(yǎng)分素的吸取利用資料。供給人群養(yǎng)分素攝入水平的資料以及最大可能攝入水平對人群膳食模式影響評估的資料。生產加工對安全性影響的評價應供給與非轉基因比照物相比，生產加工、儲存過程是否可轉變轉基因植物產品特性的資料，包括加工過程對轉入DNA和蛋白質的降解、消退、變性等影響的資料，如油的提取和精煉、微生物發(fā)酵、轉基因植物產品的加工、貯存等對植物中表達蛋白含量的影響。按個案分析的原則需要進展的其它安全性評價對關鍵成分有明顯轉變的轉基因植物，需供給其轉變對食用安全性和養(yǎng)分學評價資料。二、階段要求以下規(guī)定是申請該階段時所需材料的根本要求?！惨弧成暾堉虚g試驗供給外源插入序列的分子特征資料。供給每一個轉化體的轉基因植株自交或雜交代別及PCR檢測的資料。按《轉基因植物及其產品食用安全評價導則》〔NY/T1101-2023〕供給受體植物、基因供體生物的安全性評價資料。供給表達蛋白質的分子和生化特征等信息，以及供給表達蛋白質與毒蛋白質和抗養(yǎng)分因子氨基酸序列相像性比較的資料。供給抗蟲植物表達蛋白質和已商業(yè)化種植的轉基因抗蟲植物對靶標害蟲作用機制的分析資料，評估交互抗性的風險?！捕成暾埈h(huán)境釋放申請中間試驗供給的相關資料，以及中間試驗結果的總結報告。供給每個轉基因株系中目的基因的PCR明轉基因株系的代別和編號。供給每個轉基因株系中目的基因和標記基因整合進雜交圖和插入拷貝數，并注明轉基因株系的代別和編號。供給目的基因在轉錄水平或翻譯水平表達的資料。供給轉基因株系遺傳穩(wěn)定性的資料，包括目的基因和標記基因整合的穩(wěn)定性、表達的穩(wěn)定性和表型性狀的穩(wěn)定性?？共∠x轉基因植物，供給目標蛋白的測定方法，植物不同發(fā)育階段目標蛋白在各器官中的含量，以及對靶標生物的田間抗性效率。蛋白質〔包括目標基因和標記基因所表達的蛋白質〕在植物食用和飼用部位表達含量的資料。供給靶標害蟲對抗蟲植物和已商業(yè)化種植的抗蟲植物交互抗性的爭論資料。供給對可能影響的非靶標生物的室內生物測定資料。供給目標性狀和功能的評價資料。如，抗蟲植物應明確靶標生物種類并供給室內或田間生測報告。〔三〕申請生產性試驗申請環(huán)境釋放供給的相關資料，以及環(huán)境釋放結果的總結報告。供給轉化體外源插入片段〔如目的基因和標記基因等〕PCR檢測圖、So