蛋白質(zhì)膜的分離與定性

蛋白質(zhì)膜的分離與定性

細(xì)胞膜（pm）是所有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。質(zhì)膜蛋白質(zhì)執(zhí)行細(xì)胞與外界環(huán)境以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)換和信號(hào)傳遞等功能。質(zhì)膜功能主要依賴于其中的蛋白質(zhì),膜蛋白在細(xì)胞生命活動(dòng)中承擔(dān)各種重要功能,人類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白質(zhì)中有1/3為膜蛋白,但已知結(jié)構(gòu)功能的膜蛋白數(shù)目卻只占整個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的1%左右。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的藥物靶標(biāo)中,大約有2/3是質(zhì)膜蛋白質(zhì)。因此,細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。然而,盡管近年來(lái)蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)取得了很大的發(fā)展,但膜蛋白尤其是整合膜蛋白的分析仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn),這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)膜蛋白質(zhì)不僅豐度低,而且由于疏水性強(qiáng)而溶解性差和易于聚集沉淀,給蛋白質(zhì)的提取、酶解和鑒定帶來(lái)了很多困難,因此質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的難點(diǎn)。在細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究過(guò)程中,高純度的質(zhì)膜蛋白是深入研究的重要基礎(chǔ),本文結(jié)合差速離心和連續(xù)蔗糖密度梯度離心法,富集生物質(zhì)膜,其中差速離心利用不同速度使質(zhì)膜成分各自分離,而密度梯度離心則是基于各亞細(xì)胞器的密度不同而在如蔗糖等介質(zhì)中進(jìn)行分離。接著又采用雙水相法進(jìn)一步純化生物質(zhì)膜。在本研究中,考慮到乳腺癌腫瘤組織質(zhì)膜的密度和細(xì)胞器密度的相近性,采用連續(xù)蔗糖密度梯度離心法:在濃度50%～10%的蔗糖中,質(zhì)膜層主要集中于40%～30%,顯現(xiàn)一段較寬的區(qū)帶,而質(zhì)膜的密度主要受控于膜蛋白的種類以及分布。質(zhì)膜的分離提純不能靠單一方法,通過(guò)以上幾種方法的聯(lián)合應(yīng)用,分離的質(zhì)膜在透射電鏡的觀察下得到證實(shí),其視野下大部分區(qū)域?yàn)榉蛛x后的質(zhì)膜結(jié)構(gòu),而Westernblot的結(jié)果也驗(yàn)證了此種方法提純的膜蛋白相對(duì)全組織裂解產(chǎn)物有明顯提高。由于所得的蛋白質(zhì)復(fù)合物分子量較大(>200000),傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳無(wú)法取得理想的分離效果,本文采用藍(lán)綠溫和膠凝膠電泳(blue-nativepolyacrylamidegelelectrophoresis,BN)進(jìn)行一維分離,垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳二維分離,然后通過(guò)質(zhì)譜來(lái)對(duì)凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分析和鑒定并找出相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)儀器和試劑乳腺癌腫瘤組織共20例,均為南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科2011年1月～2012年7月切除乳腺癌患者送檢的組織標(biāo)本。二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、蔗糖、脫氧膽酸鈉、聚乙二醇(PEG3350)、葡聚糖T500(DextranT500)(Sigma-Aldrich公司,美國(guó))。實(shí)驗(yàn)用水來(lái)自于Milli-QPlus純化系統(tǒng)(Millipore公司,美國(guó))。其他試劑均購(gòu)自南京國(guó)藥集團(tuán)。ECLPuls顯色液(GEHealthcare,美國(guó))。透射電鏡為日本電子JEOL-1010,超薄切片機(jī)(LEICA,德國(guó)),納升級(jí)液相色譜(WatersNanoUPLC,美國(guó)),線性離子阱串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀(OrbitrapXL,ThemoLTQ公司,美國(guó)),超速離心機(jī)(OptimaL-100XPUltracentrifuge,BeckmanCoulter公司,美國(guó))。1.2方法1.2.1粗質(zhì)膜的分離純化將乳腺腫瘤組織剪碎洗滌,加液氮研磨成粉末。用勻漿緩沖液(50mmol/L蔗糖,pH7.4,1mmol/L氯化鈣,0.1mmol/L蛋白酶抑制劑)溶解。將上述溶液離心(4℃,600g)10min。取上清液離心(4℃,24000g)30min,用2ml勻漿緩沖液混勻沉淀,向連續(xù)梯度蔗糖溶液(濃度50%～10%)中加入粗質(zhì)膜樣品離心(4℃,24000g)8h。分層收集離心管中的質(zhì)膜條帶部分,分別測(cè)定其蔗糖濃度。含質(zhì)膜的樣品用洗滌液(50mmol/L蔗糖,0.1mmol/L蛋白酶抑制劑)離心洗滌。將所得含質(zhì)膜的樣品加入PEG3350和DextranT500兩相混合液(7∶13)中,4℃下靜置過(guò)夜,將PEG3350富集得到的上相,用洗滌液離心洗滌。保存于-70℃冰箱。1.2.2綠色和平膠凝膠的電泳1.2.2.聚乙二醇辛基苯基醚的合成從-70℃冰箱里取出質(zhì)膜樣品,置于37℃水浴鍋中使其快速融化。之后向管中加入溶解液A(25mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸,20%甘油,2%十二烷基麥芽糖,pH7.0),使EP管中溶液總體積達(dá)到1.2ml。18000g冷凍離心20min,棄上清取沉淀,并稱取沉淀的重量。按照去垢劑∶蛋白為3∶1的比例加入20%聚乙二醇辛基苯基醚溶液,使聚乙二醇辛基苯基醚的終濃度為2%,用槍頭小心混勻樣品,置于冰上裂解30min。然后18000g冷凍離心20min,收集上清,測(cè)定蛋白含量。1.2.2.2級(jí)取出120μg的樣品,加入3μl5%考馬斯亮藍(lán)G250溶液和5μl50%的甘油,混勻后上樣。1.2.2.羥甲基甲基甲烷處理好的樣品用微量進(jìn)樣器點(diǎn)在上樣孔中后,倒入1×負(fù)極液(甘氨酸8.95g、咪唑0.51g、考馬斯亮藍(lán)0.2g加雙蒸水至500ml)和正極液(15mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸,50mmol/L三羥甲基甲基甘氨酸),恒壓100V開始電泳,待樣品跑過(guò)濃縮膠后,電壓改為250V,之后可以慢慢增大,到樣品最后跑完,過(guò)程中需要控制電流在50mA以內(nèi)。待樣品跑到凝膠的1/3處更換負(fù)極液,電極緩沖液(三羥甲基氨基甲烷3.03g,甘氨酸14.4g,十二烷基硫酸鈉1g,加雙蒸水至1000ml)。1.2.2.固定凝膠的制備電泳結(jié)束后,用固定液(50%去離子水,40%甲醇,10%乙酸)固定凝膠30min,水洗4次,每次15min。然后將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染液中染色過(guò)夜。1.2.2.5恢復(fù)將凝膠根據(jù)條帶的位置切成長(zhǎng)條,置于含有1%十二烷基硫酸鈉,1%巰基乙醇溶液中平衡2h,水洗20min。1.2.2.壓膠片的膠壓將平衡好的膠條擺在二向SDS膠的濃縮膠膠面上,用壓膠片把膠條壓緊,使二者緊密結(jié)合,并保證兩個(gè)膠面之間沒有氣泡,再向膠面上封一層瓊脂糖(0.05g瓊脂糖,10ml電極緩沖液,30μl溴酚藍(lán))。1.2.2.電極緩沖液緩沖電泳等瓊脂糖凝固后,將玻璃板擺到電泳槽上,倒入電極緩沖液,以25mA恒流開始電泳。等樣品跑過(guò)濃縮膠后,將電流改為45mA直到電泳結(jié)束。1.2.2.染色時(shí)間的確定固定液(100ml乙醇,25ml乙酸,125ml雙蒸水)固定凝膠30min,敏化液(0.5g硫代硫酸鈉,17g乙酸鈉,75ml乙醇,最后定容至250ml)敏化30min,水洗3次,每次5min,加入銀染液(0.625g硝酸銀加水至250ml)染色20min,水洗2次,每次1min,加入顯影液(6.25g碳酸鈉,50μl甲醛溶于250ml水中),3～5min以后倒掉顯影液,快速加入終止液(3.65gEDTA溶于250ml水中)終止20min。1.2.3通過(guò)測(cè)試膜的純度1.2.3.免疫組化檢測(cè)血清na和k--atp酶抗體的表達(dá)將分裂所得質(zhì)膜蛋白進(jìn)行SDS分離(100V,1h),轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,放入1×TBST緩沖液中清洗3次,每次5min。用封閉液(1%牛血清白蛋白,10mmol/L三羥甲基氨基甲烷pH7.5,100mmol/L氯化鈉,0.1%Tween20)37℃封閉1h。以Na+K+-ATP酶抗體為一抗(1∶1000),以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗(1∶8000)。用ECLPlus試劑盒檢測(cè)膜上抗原抗體復(fù)合物。1.2.3.丙酮脫水試驗(yàn)用2.5%戊二醛固定新鮮的膜樣品,室溫固定過(guò)夜,按如下方法進(jìn)行樣品制備和電鏡觀察:用PBS洗膜3次,每次15min;2%鋨酸固定1h;用PBS洗膜3次,每次15min。依次用25%、50%、75%、95%和100%丙酮脫水。環(huán)氧樹脂浸漬過(guò)夜,包埋聚合后進(jìn)行超薄切片,切片厚度為60～70nm,并收集于銅網(wǎng)上,用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,在透射電鏡下觀察。1.2.4蛋白質(zhì)鑒定1.2.4.dtt水浴過(guò)程膠粒加乙腈50μl脫水5min后3000g離心5min,吸去乙腈晾干。加入10mmol/LDTT50μl,56℃水浴1h。吸干DTT后,加入55mmol/LIAA50μl,置于暗室45min,吸干IAA后,依次用25mmol/L碳酸氫銨、50%的乙腈及100%乙腈脫水,晾干,加入10ng/μl的胰酶酶切過(guò)夜。1.2.4.儀器和質(zhì)譜條件酶解產(chǎn)物用0.1%乙酸溶解,離心后用納升級(jí)液相色譜分離,色譜柱為C18反相柱(100μmid×15cm),上樣量為100ng的肽段混合物,控制流速為500nl/min。帶有納噴離子源的線性離子阱串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀與納升級(jí)液相色譜相連,用來(lái)鑒定肽段,噴霧電壓1.3kV,質(zhì)譜一級(jí)掃描范圍400～1800,分離寬度為3Da;串聯(lián)質(zhì)譜分析采用一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)碎片掃描模式(data-dependentmode)依次選取一級(jí)質(zhì)譜中離子強(qiáng)度最高的5個(gè)離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜,二級(jí)質(zhì)譜條件設(shè)定為:自動(dòng)增益控制(1×106個(gè)離子),1次微掃描,歸一化能量為35%。1.2.4.3.蛋白質(zhì)的測(cè)定2結(jié)果2.1等電聚焦電泳藍(lán)綠溫和膠凝膠電泳分離出23種蛋白質(zhì)復(fù)合物。在通常等電點(diǎn)聚焦電泳時(shí),由于膜蛋白的疏水性使其不易在常用的雙向凝膠電泳裂解液中完全溶解,相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大的酸性或堿性蛋白質(zhì)在等電聚焦條件下容易丟失。于是我們選擇使用一維垂直電泳來(lái)分離質(zhì)膜蛋白,在SDS的條件下讓膜蛋白直接按照分子大小進(jìn)行電泳并分離,而跳過(guò)易使疏水性整合膜蛋白質(zhì)聚集沉淀的等電聚焦電泳步驟,避免了疏水性膜蛋白的丟失。如圖1所示,藍(lán)綠溫和膠凝膠電泳從質(zhì)膜蛋白樣品中分離出23個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物條帶。2.2sternblot構(gòu)建Na+/K+-ATP酶是細(xì)胞膜特異的整合膜蛋白,通過(guò)其單克隆抗體對(duì)富集前后提取的蛋白進(jìn)行Westernblot驗(yàn)證,如圖2所示,通過(guò)灰度比對(duì)可看出,富集后Na+/K+-ATP酶的含量相對(duì)于全組織裂解產(chǎn)物有明顯提高。有文獻(xiàn)報(bào)道本文所用方法富集得到的Na+/K+-ATP酶含量比密度梯度離心純化提高了10倍,抗體免疫磁珠純化提高了5倍,比生物素標(biāo)記法純化提高了2.5倍。2.3電鏡觀察的結(jié)果如圖3所示,膜結(jié)構(gòu)所占比例較大,圖中可見3片較大區(qū)域的膜結(jié)構(gòu)圍成類似空泡的結(jié)構(gòu),其他區(qū)域可見較多散在的較小的膜結(jié)構(gòu)。2.4生物生態(tài)學(xué)檢測(cè)對(duì)第一相分離的23個(gè)蛋白復(fù)合物條帶和第二相分離出的135種蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定,并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)135種蛋白中,有78種質(zhì)膜蛋白和與膜相關(guān)的蛋白質(zhì),其余的57種蛋白質(zhì)來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核等細(xì)胞器膜。3質(zhì)膜蛋白質(zhì)分離純化的應(yīng)用蛋白質(zhì)組的研究通常利用二維凝膠電泳(2DE)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離,然后通過(guò)質(zhì)譜(MS)及生物信息學(xué)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)從而進(jìn)一步對(duì)凝膠蛋白進(jìn)行分析鑒定。但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,由于膜蛋白的疏水性,無(wú)法在常用的雙向電泳中獲得完全分離的膜蛋白。在本研究中,選擇使用藍(lán)綠溫和膠凝膠電泳來(lái)分離質(zhì)膜蛋白,跳過(guò)等電聚焦電泳,避免了疏水性膜蛋白的丟失。經(jīng)一維SDS電泳之后,獲得多個(gè)蛋白質(zhì)混合物條帶后,繼而采用毛細(xì)管高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)蛋白質(zhì)條帶的酶切物進(jìn)行分離鑒定,以達(dá)到先用高效液相色譜分離肽段,然后再利用串聯(lián)質(zhì)譜得到碎片離子圖來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的目的。結(jié)果表明除了78種質(zhì)膜相關(guān)蛋白之外的其余57種蛋白大多來(lái)自于內(nèi)膜系統(tǒng),這是由于整個(gè)內(nèi)膜系統(tǒng)具有的均一性,使得線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與膜片的密度很接近,從而分離出的蛋白質(zhì)中有屬于內(nèi)膜系統(tǒng)的膜蛋白,如HSPs和PDIs通常被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)蛋白或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白,在最近的研究中揭示了這些蛋白的膜定位,所以單純基于密度差異而分離物質(zhì)的蔗糖密度梯度離心法難以使這些細(xì)胞器完全分離。還有一部分蛋白質(zhì)在可能已有的數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有明確的功能和定位信息,故而不能明確其位置,其中很可能包含部分質(zhì)膜及與膜功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中分離得到的大多數(shù)蛋白為質(zhì)膜相關(guān)蛋白及其復(fù)合物,但在結(jié)果中仍存在少量非膜相關(guān)蛋白,與經(jīng)典的蛋白富集技術(shù)相比,本實(shí)驗(yàn)分離出的蛋白中非膜蛋白比例已經(jīng)明顯降低。藍(lán)綠溫和凝膠電泳作為一種高效的電泳技術(shù),在蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離以及研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用,但在第二相SDS分離時(shí)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)容易發(fā)生拖尾和橫紋現(xiàn)象,這個(gè)缺點(diǎn)制約了該技術(shù)的使用。為了減小各條帶間的干擾,減少拖尾和橫紋的現(xiàn)象,在實(shí)驗(yàn)中對(duì)傳統(tǒng)的BN/SDS做了一些改進(jìn),即將藍(lán)綠溫和凝膠電泳分離得到的各個(gè)復(fù)合物條帶直接切下,經(jīng)平衡后插入第二相SDS的加樣孔中,固定位置,這樣便可以得到清晰銳利的蛋白質(zhì)條帶(斑點(diǎn))。多種方法的聯(lián)合彌補(bǔ)了一維電泳的缺陷,在蛋白鑒定結(jié)果中體現(xiàn)了比較明顯的改進(jìn)作用。本文主要是針對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白復(fù)合物進(jìn)行研究,質(zhì)膜蛋白的分離純化是實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ),由于質(zhì)膜蛋白具有低豐度、難溶性等特點(diǎn),決定了單一方法無(wú)法滿足提純需要,所以本研究結(jié)合了差速離心與蔗糖密度梯度離心以及利用細(xì)胞器表面電荷的兩相分配的雙水相法對(duì)生物質(zhì)膜進(jìn)行質(zhì)膜蛋白的提純。質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究是復(fù)雜而艱難的,但對(duì)各種相關(guān)