玻璃化冷凍對豬卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)、染色體和微絲分布的影響

玻璃化冷凍對豬卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)、染色體和微絲分布的影響

隨著動物育種和水生生物材料的發(fā)展，動物卵母細(xì)胞的冷凍保存表明了保護(hù)動物物種資源的潛在價值。多種動物卵母細(xì)胞已被成功冷凍(Vajtaetal,1998),但其凍后的受精率、發(fā)育率仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于新鮮卵母細(xì)胞。有很多因素影響卵母細(xì)胞的冷凍保存。在這些因素中,卵母細(xì)胞的自身結(jié)構(gòu)及其功能變化,是一個不可忽視的重要因素。研究表明,多數(shù)哺乳動物第二次減數(shù)分裂中期(MetaphaseⅡ,MⅡ)卵母細(xì)胞紡錘體對低溫特別敏感,當(dāng)卵母細(xì)胞被冷卻至室溫或更低溫度時,構(gòu)成紡錘體的微管發(fā)生部分或全部解聚,進(jìn)而導(dǎo)致染色體分布異常,影響其后的受精與發(fā)育(Boisoetal,2002;Rojasetal,2004;Albarracinetal,2005)。小鼠卵母細(xì)胞紡錘體在0℃維持45—60min后完全解聚(Magistrini&Szollosi,1980);人卵母細(xì)胞紡錘體在室溫或更低溫度時,也發(fā)生部分或全部解聚(Almeida&Bolton,1995)。盡管復(fù)溫后卵母細(xì)胞紡錘體可恢復(fù),但恢復(fù)程度在復(fù)溫后培養(yǎng)時間和動物種類上均有很大差異(Magistrini&Szollozi,1980;Aman&Parks,1994;Wangetal,2001)。處于Germinalvesicle(GV)期的卵母細(xì)胞,其紡錘體尚未形成,但研究發(fā)現(xiàn)該期卵母細(xì)胞冷凍后,存活力與發(fā)育能力也有降低(Parketal,1997;Rojasetal,2004),相關(guān)原因仍不明了。OPS(openpulledstraw)法玻璃化冷凍,是新近發(fā)展起來的一種用于哺乳動物胚胎和卵母細(xì)胞冷凍保存的方法。由于其冷凍速率快,冷凍液用量少,有助于降低卵母細(xì)胞的冷凍損傷,是當(dāng)前用于卵母細(xì)胞冷凍保存的理想方法之一(Vajtaetal,1998)。近年來,本實(shí)驗室對豬卵母細(xì)胞冷凍保存進(jìn)行了系統(tǒng)研究,冷凍研究結(jié)果表明,豬GV期與體外成熟MⅡ期卵母細(xì)胞在經(jīng)OPS法玻璃化冷凍后,存活力與體外受精胚發(fā)育能力與新鮮卵母細(xì)胞相比均明顯下降,GV期與MⅡ期卵母細(xì)胞間也有明顯差異,以GV期卵母細(xì)胞冷凍保存效果為佳。為了進(jìn)一步查明冷凍損傷的機(jī)理,作為該系統(tǒng)研究的一部分,本試驗側(cè)重對豬卵母細(xì)胞冷凍后,其紡錘體結(jié)構(gòu)、染色體排列與微絲分布進(jìn)行比較分析,以澄清卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后,對細(xì)胞骨架造成的影響,為進(jìn)一步探討影響豬卵母細(xì)胞冷凍保存的機(jī)理提供實(shí)驗參考。1材料和方法1.1u3000酸、堿、m期卵母細(xì)胞的制備GV期卵母細(xì)胞是用抽吸法從屠宰豬卵巢表面直徑2—5mm卵泡中采集,選用胞質(zhì)均勻、包被3層及3層以上卵丘細(xì)胞的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC),用10%新生牛血清(NCS,GIBCOBRL產(chǎn)品)和TCM199(GIBCO產(chǎn)品)洗2—3次后備用。所采集的COC經(jīng)體外成熟,即可獲得MⅡ期卵母細(xì)胞(Fujihiraetal,2004)。方法是每15枚COC一組,置于100μL成熟培養(yǎng)液中,在38.5℃、5%CO2氣相及飽和濕度條件下培養(yǎng)44h。1.2u3000gv期卵母細(xì)胞的制備本試驗所用MⅡ期卵母細(xì)胞,均由GV期卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)后獲得。以0.1%透明質(zhì)酸酶溶液處理MⅡ期卵母細(xì)胞約5min,并經(jīng)吸管吹打去除擴(kuò)散的卵丘細(xì)胞,經(jīng)TCM199培養(yǎng)液洗2—3次后,用于玻璃化冷凍;以COC形式存在的GV期卵母細(xì)胞直接用于冷凍。豬卵母細(xì)胞先在20%乙二醇(EG,上海試劑一廠生產(chǎn))TCM199液中平衡5min,轉(zhuǎn)入40%EG+0.5mol/L蔗糖(上?；瘜W(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)TCM199液中,于30s內(nèi)裝入OPS管,每管裝入5枚卵母細(xì)胞,約2μL玻璃化液。裝管后立即投入-196℃液氮內(nèi)冷凍保存。解凍時,將OPS管從液氮取出直接置于37℃的0.5mol/L蔗糖溶液中,回收卵母細(xì)胞;平衡5min后,將回收的卵母細(xì)胞再轉(zhuǎn)入0.25mol/L蔗糖溶液中平衡5min,TCM199培養(yǎng)液洗2—3次備用。1.3檢測大鼠cy5、fic及pi基因表達(dá)用3.7%多聚甲醛(上海凌峰試劑有限公司生產(chǎn))PBS液固定卵母細(xì)胞30min,經(jīng)PBS洗3次后,轉(zhuǎn)入0.4%TritonX-100(Boster產(chǎn)品)PBS中作穿透處理30min,再轉(zhuǎn)入0.2%牛血清白蛋白(BSA,SIGMA試劑)PBS中封閉1h;之后對卵母細(xì)胞的微絲、微管及染色體作共染處理。固定、穿透、封閉和染色處理均在37℃下進(jìn)行。封閉后的卵母細(xì)胞與抗α微管蛋白單克隆抗體(1∶50,NeoMarkers產(chǎn)品)共同孵育1.5—2h,再與抗小鼠IgG-生物素(1∶50,Boster產(chǎn)品)孵育1h,再與抗生物素蛋白(Cy5,2μg/mL,Rockland產(chǎn)品)共同孵育30min;然后與鬼筆環(huán)肽(FITC,0.2μg/mL,ALEXIS產(chǎn)品)共同孵育1h,最后在500μg/mL碘化丙啶(PI,Boster產(chǎn)品)中染色20min。以上每次孵育后,均使用37℃預(yù)熱的0.1%Tween20(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)PBS(V/V)液洗4次,10min/次。染色結(jié)束后,整裝壓片,用無色指甲油封片(Chenetal,2000;Liuetal,2003;Albarracinetal,2005)。微管、微絲及染色體分別通過Cy5、FITC及PI定位,在激光掃描共聚焦顯微鏡TCSSP2下觀察其形態(tài)分布并攝片,三者分別呈藍(lán)、綠和紅色。卵母細(xì)胞紡錘體被歸為3類:(1)正常紡錘體:紡錘體呈桶狀,染色體以不連續(xù)的束狀排列于赤道板,微管橫穿紡錘體,從一極橫跨另一極,或從紡錘體極擴(kuò)展到染色體;(2)異常紡錘體:微管沒有排列成典型的紡錘體構(gòu)型,或部分微管發(fā)生解聚;(3)無紡錘體出現(xiàn):染色體周圍沒有觀察到微管存在(Liuetal,2003)。卵母細(xì)胞染色體被歸為3類:(1)正常染色體:染色體排列在紡錘體赤道板上,或在無典型紡錘體存在時,致密存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的某一位置;(2)異常染色體:染色體分散存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi);(3)染色體消失:細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無染色體存在(Liuetal,2003)。卵母細(xì)胞微絲分布則被分為(1)正常微絲:在質(zhì)膜下可見均勻的肌動蛋白層;(2)異常微絲:在質(zhì)膜下肌動蛋白呈不連續(xù)分布,或肌動蛋白帶發(fā)生彌散;(3)無微絲存在:卵母細(xì)胞內(nèi)沒有觀察到F-肌動蛋白存在(Albarracinetal,2005)。1.4實(shí)驗設(shè)計分別以豬GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞為研究對象,比較經(jīng)冷凍保護(hù)劑處理和玻璃化冷凍后卵母細(xì)胞紡錘體、染色體及微絲的變化。1.4.1不同保護(hù)劑對卵母細(xì)胞的影響GV期卵母細(xì)胞分為3組:(1)對照組:卵母細(xì)胞不作任何處理,但進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)44h;(2)冷凍保護(hù)劑處理組:卵母細(xì)胞不作冷凍,但經(jīng)過凍前、凍后的處理程序,再進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)44h;(3)玻璃化冷凍組:卵母細(xì)胞經(jīng)OPS法玻璃化冷凍—解凍后,體外成熟培養(yǎng)44h。各組均在成熟培養(yǎng)結(jié)束后行免疫熒光染色、檢查。1.4.2不同培養(yǎng)條件外引回血卵母細(xì)胞MⅡ期卵母細(xì)胞分為3組:(1)對照組:新鮮卵母細(xì)胞不作處理直接染色;(2)冷凍保護(hù)劑處理組:體外成熟培養(yǎng)42h的卵母細(xì)胞不作冷凍,但經(jīng)過凍前、凍后的處理程序,之后繼續(xù)培養(yǎng)2h,再行染色;(3)玻璃化冷凍組:COC經(jīng)體外成熟培養(yǎng)42h后,用OPS法進(jìn)行玻璃化冷凍,解凍后再培養(yǎng)2h、染色(Albarracinetal,2005)。1.5統(tǒng)計方法實(shí)驗重復(fù)3次以上,所獲數(shù)據(jù)用ANOVA作差異顯著性分析。2結(jié)果2.1冷凍保護(hù)劑對豬gv期卵母細(xì)胞微絲分布的影響如表1所示,經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察,對照組58枚受試卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)后,79.5%表現(xiàn)為正常紡錘體(圖1A),15.6%表現(xiàn)異常(圖1B、C、D),4.8%未見紡錘體(圖1E)。正常紡錘體卵母細(xì)胞,其染色體都排列在赤道板上;8枚異常紡錘體卵母細(xì)胞,其染色體表現(xiàn)正常;1枚未見紡錘體卵母細(xì)胞,亦未觀察到染色體的存在;其余3枚卵母細(xì)胞,染色體分散于細(xì)胞質(zhì)中。在冷凍保護(hù)劑處理組與冷凍組,卵母細(xì)胞培養(yǎng)后,其紡錘體正常率均顯著下降,并且冷凍組明顯低于冷凍保護(hù)劑處理組(P<0.05);異常紡錘體和無紡錘體的卵母細(xì)胞比率也有顯著上升(P<0.05)。冷凍保護(hù)劑處理組與冷凍組的染色體正常率降低,且冷凍組染色體正常率顯著低于對照組(P<0.05)。處理組與冷凍組的染色體分散率增多,且冷凍組與對照組差異顯著(P<0.05)。有趣的是,在異常紡錘體卵母細(xì)胞中,大多仍有正常的染色體排列(圖1B)。冷凍保護(hù)劑處理與玻璃化冷凍對豬GV期卵母細(xì)胞微絲分布的影響見表2。冷凍保護(hù)劑處理組與冷凍組卵母細(xì)胞,經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后的微絲分布正常率均顯著下降,異常分布增加。2.2化冷凍后各主要指標(biāo)的測定MⅡ期卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍保護(hù)劑處理或玻璃化冷凍后,其紡錘體和染色體正常率等指標(biāo)列入表3;冷凍保護(hù)劑處理與玻璃化冷凍對豬MⅡ期卵母細(xì)胞微絲分布的影響見表4。3不同冷凍保護(hù)劑對gv期紡錘體的影響有關(guān)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的早期研究表明,細(xì)胞骨架的主要功能是對細(xì)胞器膜層結(jié)構(gòu)進(jìn)行組織和固定,其中起主要作用的是微絲和微管。研究發(fā)現(xiàn),微絲和微管同樣與卵母細(xì)胞成熟、受精及胚胎發(fā)育關(guān)系密切,并對其中的一些動力學(xué)事件起著決定性的作用(Chenetal,2004;Kimetal,1996,1998)。卵母細(xì)胞成熟紡錘體主要由微管構(gòu)成,且在紡錘體之外并無微管存在(Inoue,1981)。正常染色體在微管裝配為紡錘體及胚胎發(fā)育過程中都具有重要作用(Zhang&Nicklas,1995;Erogluetal,1998)。因此,在卵母細(xì)胞成熟、受精及其后的發(fā)育過程中,微絲、微管和染色體的功能是相互協(xié)調(diào)、密不可分的。卵母細(xì)胞紡錘體對低溫非常敏感,經(jīng)低溫處理的不同動物卵母細(xì)胞,復(fù)溫后紡錘體恢復(fù)程度也不相同。Liuetal(2003)報道,豬MⅡ期卵母細(xì)胞在24℃維持5min,紡錘體即開始解聚;當(dāng)溫度降至4℃時,其解聚速度加快,復(fù)溫后紡錘體恢復(fù)程度很有限。Pickering&Johnson(1987)報道,小鼠卵母細(xì)胞于4℃放置1h后,當(dāng)溫度恢復(fù)到37℃時,有89%的卵母細(xì)胞恢復(fù)正常的紡錘體形態(tài)。由此可見,豬卵母細(xì)胞紡錘體對于低溫環(huán)境更為敏感。本試驗結(jié)果表明,OPS法玻璃化冷凍后,無論是GV期還是MⅡ期豬卵母細(xì)胞,紡錘體形態(tài)正常率均比對照組顯著下降;即使是不作冷凍,僅用冷凍保護(hù)劑處理,也會影響到紡錘體形態(tài)。有報道表明,卵母細(xì)胞對于玻璃化液處理也很敏感(Rojasetal,2004;Albarracinetal,2005),本實(shí)驗進(jìn)一步佐證了這些報道的結(jié)果。構(gòu)成紡錘體的微管,主要是由α和β微管蛋白及少量微管結(jié)合蛋白(MAP)聚合而成。冷凍液或冷凍導(dǎo)致紡錘體結(jié)構(gòu)破壞,可能是由于這些因素誘導(dǎo)了微管蛋白解聚,破壞了正常的微管結(jié)構(gòu),進(jìn)而導(dǎo)致紡錘體形成發(fā)生紊亂或不能形成。在MⅡ期卵母細(xì)胞,染色體通過著絲粒捕獲紡錘體微管,并排列于成熟紡錘體赤道板上,這種方式保證了受精后染色體的正確分離,正常染色體反過來又增強(qiáng)了紡錘體微管的裝配。因此,一旦紡錘體受到破壞,受精后的染色體分離便發(fā)生異常,胚胎的非整倍體及多倍體發(fā)生率增加,胚胎的正常發(fā)育會受到影響。此外,當(dāng)染色體發(fā)生異常時,微管雖可在染色體周圍進(jìn)行組裝,但不能形成正常紡錘體(Liuetal,2003)。本實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)的一些異常紡錘體情況,推測也是由上述的一些變化引發(fā)的。因此,減少紡錘體與染色體損傷,對卵母細(xì)胞的成熟、受精與發(fā)育都具有重要的意義。GV期卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)存在大量微絲,在卵母細(xì)胞經(jīng)歷生發(fā)泡破裂(GVBD)而進(jìn)入第一次成熟分裂中期(MⅠ期)后,微絲減少;但微絲并不是GVBD發(fā)生的必要條件。Longo&Chen(1985)報道,微絲和微管破壞并沒有阻斷GVBD和染色體凝集,然而卵母細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育會受到抑制。在豬上,卵母細(xì)胞微絲不影響GVBD、染色體凝集和MⅠ期紡錘體形成等早期成熟分裂發(fā)育,但微絲破壞后,MⅠ期紡錘體位置及隨后的成熟過程會受到抑制(Sunetal,2001)。對小鼠卵母細(xì)胞的研究表明,在卵母細(xì)胞成熟過程中,微絲與微管影響皮質(zhì)顆粒向皮質(zhì)區(qū)的遷移(Connorsetal,1998);而只有皮質(zhì)顆粒出現(xiàn)于皮質(zhì)區(qū),卵母細(xì)胞才能達(dá)到成熟。在GV期卵母細(xì)胞,染色體仍位于細(xì)胞核內(nèi)、紡錘體尚未形成,但冷凍液或冷凍處理破壞了微絲的裝配,進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的成熟。Sunetal(2001)報道,豬卵母細(xì)胞受精時,微絲在精子穿透中起重要作用。Wangetal(2000)在豬卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn),若F-肌動蛋白聚合受到抑制,則會阻止卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的進(jìn)程。因此,對于MⅠ期卵母細(xì)胞來說,冷凍液或冷凍處理后,即使紡錘體和染色體仍正常,若微絲受到破壞,受精率和胚胎發(fā)育率也會降低。Aigneretal(1992)的研究也表明,冷凍保護(hù)劑破壞了皮質(zhì)內(nèi)微絲網(wǎng)絡(luò),引起構(gòu)成紡錘體的微管解聚,導(dǎo)致紡錘體形成發(fā)生紊亂或不能形成,染色體