小堿與蛋白質(zhì)的相互作用研究

小堿與蛋白質(zhì)的相互作用研究

1藥物與血清白蛋白的相互作用茴香堿（俗稱黃連素）主要存在于異羥色胺類、罌粟科、毛茸茸和脫氧核糖屬植物中。臨床上常用作抗菌藥,療效顯著。隨著近些年的深入研究,發(fā)現(xiàn)小檗堿在抗炎、抗腫瘤、降血糖以及治療心血管系統(tǒng)疾病方面都有顯著作用。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),是血液總滲透壓的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)。它的另一作用是在血液循環(huán)中作為許多內(nèi)源性和外源性的倉(cāng)儲(chǔ)及轉(zhuǎn)運(yùn)分子,能與代謝物、微生物、金屬離子及藥物等分子結(jié)合。研究藥物與血清白蛋白的結(jié)合過(guò)程,有助于了解藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝過(guò)程,有利于藥物的開發(fā)研究與臨床使用。目前,研究藥物與血清白蛋白相互作用的手段主要有光譜法、毛細(xì)管電泳法、平衡透析法和核磁共振技術(shù)。徐倩等利用熒光光譜法和分子以接研究了4種黃酮與BSA的相互作用,確定了它們之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)。吳鴻偉等采用毛細(xì)管電泳技術(shù),研究了鹽酸普羅帕酮與人血清白蛋白的結(jié)合作用機(jī)制。隨著NMR技術(shù)的不斷發(fā)展,應(yīng)用NMR研究藥物與蛋白的結(jié)合作用逐漸受到關(guān)注。與其它方法相比,NMR具有獨(dú)特優(yōu)點(diǎn),如樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、非侵入性、重復(fù)性好等;此外,它不僅能提供藥物和血清白蛋白的結(jié)合部位和結(jié)合強(qiáng)度信息,而且還能通過(guò)弛豫時(shí)間等核磁參數(shù)得到藥物與蛋白結(jié)合的動(dòng)力學(xué)及空間構(gòu)象變化情況等。趙長(zhǎng)春等利用紫外和熒光光譜技術(shù)研究了小檗堿與人血清白蛋白的相互作用機(jī)制。曾曉蕾等通過(guò)色譜法研究了鹽酸小檗堿與BSA的結(jié)合作用,得到了結(jié)合常數(shù)等信息。然而,小檗堿與血清白蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)至今還不清楚,其結(jié)合動(dòng)力學(xué)還需進(jìn)一步研究。本研究采用NMR研究小檗堿與BSA的相互作用,通過(guò)小檗堿化學(xué)位移和弛豫時(shí)間的變化情況闡述BSA與小檗堿相互作用的結(jié)構(gòu)特征;根據(jù)小檗堿自擴(kuò)散系數(shù)求得小檗堿對(duì)BSA的表觀解離常數(shù)Kd及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,從而明確了小檗堿與BSA結(jié)合的強(qiáng)度及結(jié)合部位等信息。2實(shí)驗(yàn)部分2.1酸度計(jì)、小堿、koBrukerAVANCEIII600型高分辨核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司);AB135-S/FACT型電子分析天平(瑞士MettlerToledo公司);酸度計(jì)(瑞士MettlerToledo公司)。小檗堿(純度>98%,Sigma公司)、牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司);D2O(99.9%氘代,劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室);固體NaH2PO4和Na2HPO4(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1小堿與bsa摩爾濃度比的篩選配制0.2mmol/LBSA-磷酸鹽緩沖液(pH7.4),分別與不同濃度的小檗堿混合,配制成含小檗堿與BSA摩爾濃度比分別為10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,60∶1,80∶1,100∶1和160∶1的混合溶液,分別加10%重水鎖場(chǎng),加TSP定標(biāo)。另外配制含2mmol/L小檗堿磷酸鹽緩沖液(pH7.4)作為小檗堿1HNMR譜的結(jié)構(gòu)歸屬,所配溶液分別裝入5mm核磁管進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)。2.2.2信噪比s/n的測(cè)定NMR實(shí)驗(yàn)均在質(zhì)子頻率為600.13MHz的BrukerAVANCEIII600型高分辨NMR譜儀上完成的,實(shí)驗(yàn)溫度控制在298.0K。1HNMR譜采用90ue84aSymbolpB@脈沖序列完成,采樣點(diǎn)數(shù)32K,空掃次數(shù)4次,對(duì)不同濃度的樣品,累加次數(shù)和增益進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,以求得到較好的信噪比(S/N)。1HT1(自旋-晶格弛豫時(shí)間)的測(cè)定采用反轉(zhuǎn)恢復(fù)法來(lái)實(shí)現(xiàn),脈沖間隔時(shí)間4s。在NMR實(shí)驗(yàn)中,譜寬12000Hz,采樣點(diǎn)數(shù)32K。傅立葉變化前加窗函數(shù)LB=0.3增強(qiáng)信噪比。將譜峰的積分面積按照單指數(shù)衰減函數(shù)關(guān)系式擬合,得到各質(zhì)子的縱向弛豫速率:A(t)=A0-[A0-A(0)]exp(-R1t),其中A(t),A(0)和A0分別是在恢復(fù)時(shí)間t,0和熱平衡時(shí)的譜峰積分面積。而自擴(kuò)散系數(shù)測(cè)量采用LED-BBP脈沖序列實(shí)現(xiàn),譜峰面積按照雙指數(shù)衰減函數(shù)關(guān)系擬合,得到各譜峰的自擴(kuò)散系數(shù)D:A(b)=A(0)exp(-bD),b=(2rδG)2(Δ-δ/3)2(1)其中γ是氫質(zhì)子的旋磁比,δ和G是脈沖場(chǎng)梯度的作用時(shí)間和強(qiáng)度,Δ是有效擴(kuò)散時(shí)間,A(0)和A(b)是施加脈沖場(chǎng)梯度前后時(shí)信號(hào)強(qiáng)度。3結(jié)果與討論3.1小堿的1hnmr小檗堿的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。借助于1HNMR,13CNMR,1H-1HCOSY和HMBC等NMR技術(shù),并結(jié)合MestNova軟件模擬和文獻(xiàn),對(duì)小檗堿的1HNMR進(jìn)行了歸屬。即:δ4.09和4.05分別為16和17位甲基,δ3.18的三重峰為5位的亞甲基質(zhì)子信號(hào),δ6.07的單峰為15位的亞甲基質(zhì)子信號(hào),δ6.89,7.30,8.29和9.59分別為4,1,13和8位的CH,而δ7.95和7.82的二重峰為11和12位的CH。δ4.82處的峰為水質(zhì)子信號(hào),小檗堿中的6位亞甲基信號(hào)與水峰信號(hào)重疊,故未觀察到該質(zhì)子峰的存在,如圖1所示。3.2藥物與蛋白的相互作用通過(guò)藥物小分子的NMR參數(shù)改變可以判別藥物配體與蛋白受體的結(jié)合情況。化學(xué)位移反映的是核周圍電場(chǎng)及電子云分布狀況,當(dāng)藥物與靶蛋白結(jié)合后,藥物核周圍的化學(xué)環(huán)境會(huì)發(fā)生改變,因此可以通過(guò)檢測(cè)藥物化學(xué)位移的改變及峰型研究結(jié)合作用。另外,1HT1也是研究藥物與蛋白結(jié)合作用的常用NMR參數(shù)。當(dāng)藥物與蛋白形成配合物時(shí),結(jié)合態(tài)藥物分子的1HT1與游離態(tài)藥物相比明顯縮短。因此,通過(guò)對(duì)配體弛豫時(shí)間的觀察也能預(yù)測(cè)配體與受體的結(jié)合作用。本研究通過(guò)檢測(cè)2～32mmol/L小檗堿化學(xué)位移及其1HT1的變化,預(yù)測(cè)小檗堿分子與BSA的結(jié)合作用。3.2.1小堿濃度對(duì)其凈化效果的影響在濃度恒定的BSA溶液中分別加入2～32mmol/L小檗堿,測(cè)定不同濃度時(shí)小檗堿的1H化學(xué)位移和峰型變化(如表1)。由表1可知,隨著小檗堿濃度增加,各個(gè)質(zhì)子的化學(xué)位移不同程度的向高場(chǎng)移動(dòng),這表明BSA與小檗堿分子發(fā)生了相互作用,形成了新的復(fù)合物。但是,因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)采用固定蛋白濃度的方法,所以化學(xué)位移不會(huì)無(wú)限向高場(chǎng)移動(dòng)。由表1中各個(gè)質(zhì)子的化學(xué)位移可知,當(dāng)小檗堿濃度高于12mmol/L時(shí),各個(gè)質(zhì)子化學(xué)位移隨濃度的升高而基本沒(méi)有變化。此時(shí)結(jié)合態(tài)小檗堿濃度已趨于穩(wěn)定,由此可以推測(cè):當(dāng)12mmol/L小檗堿與0.2mmol/L牛血清白蛋白結(jié)合時(shí),溶液就已接近飽和狀態(tài)。觀察1HNMR譜可知,隨著小檗堿濃度增加,各個(gè)質(zhì)子的譜峰變寬,尤其是H-13,H-11,H-12,H-1和H-4質(zhì)子。由表1可知,H-1,H-12和H-13等環(huán)上芳香氫化學(xué)位移隨著小檗堿濃度的增加變化非常明顯,尤其當(dāng)小檗堿濃度從2mmol/L增加到12mmol/L時(shí),蛋白對(duì)小檗堿的影響尤為顯著;當(dāng)小檗堿濃度高于12mmol/L時(shí),BSA對(duì)小檗堿的環(huán)上芳香質(zhì)子影響減弱,化學(xué)位移趨于定值。而環(huán)上的15位亞甲基質(zhì)子和環(huán)外的16,17位甲基質(zhì)子化學(xué)位移隨著小檗堿濃度的增加變化不明顯,H-15,H-16和H-17受BSA的影響很小。對(duì)于H-1,H-12和H-13等環(huán)上芳香質(zhì)子,其化學(xué)位移的變化明顯大于環(huán)上5和15位的亞甲基質(zhì)子,即蛋白對(duì)小檗堿環(huán)上的芳香質(zhì)子結(jié)合作用明顯強(qiáng)于環(huán)上烷基質(zhì)子,表明芳香質(zhì)子更靠近蛋白,受蛋白的結(jié)合作用更強(qiáng)。另外,環(huán)上的芳香質(zhì)子與蛋白的作用也較環(huán)外的16和17位甲基質(zhì)子強(qiáng),這可能與甲基質(zhì)子所處的空間位阻大有關(guān),阻礙了其與蛋白的結(jié)合作用。3.2.2小堿與bsa的結(jié)合HT1的影響為了研究小檗堿與BSA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)行為,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了BSA溶液中不同濃度小檗堿質(zhì)子的1HT1,結(jié)果如表2所示。表2還列出了BSA不存在時(shí)溶液中小檗堿各質(zhì)子的1HT1值。可以看出,溶液中沒(méi)有BSA時(shí)小檗堿各質(zhì)子的1HT1值都較大,BSA溶液中小檗堿各質(zhì)子的1HT1值都明顯變短,弛豫速率加快,直接反映了BSA與小檗堿的相互作用。而且各質(zhì)子的1HT1值也隨著小檗堿濃度增加而增大,這反映了結(jié)合態(tài)小檗堿濃度越來(lái)越高。小檗堿的H-11和H-12在低濃度時(shí)的1HT1值變化較大,這可能與它們受到蛋白背景峰影響較大有關(guān)。本研究中BSA的濃度保持不變,小檗堿濃度大于12mmol/L時(shí),1HT1值趨于穩(wěn)定,因此推測(cè)12mmol/L小檗堿與0.2mmol/LBSA溶液的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài),生成的結(jié)合態(tài)小檗堿濃度基本保持不變。1HT1值對(duì)分子運(yùn)動(dòng)中的高頻運(yùn)動(dòng)較為敏感,可以由此推斷小檗堿與BSA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)情況。由表2可知,小檗堿分子上8,13,11,12,1和4位上的CH以及5和15位的CH2的質(zhì)子的1HT1值隨著小檗堿濃度的增加變化很小,結(jié)合1H化學(xué)位移變化,表明不同濃度下小檗堿與BSA結(jié)合的分子鏈運(yùn)動(dòng)沒(méi)有發(fā)生明顯變化。而環(huán)外16位甲基質(zhì)子比17位甲基質(zhì)子的1HT1值大,這可能因?yàn)镠-16遠(yuǎn)離BSA蛋白,甲基質(zhì)子由于自身內(nèi)運(yùn)動(dòng)而表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)相對(duì)自由。由此推測(cè)小檗堿與BSA結(jié)合過(guò)程中,BSA使小檗堿各個(gè)質(zhì)子的化學(xué)位不同程度的向高場(chǎng)移動(dòng),處于結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)子化學(xué)位移變化大,而其它質(zhì)子變化小。BSA的結(jié)合使得小檗堿各個(gè)質(zhì)子的1HT1弛豫時(shí)間明顯減少,質(zhì)子在溶液中運(yùn)動(dòng)受限。BSA主要與小檗堿環(huán)上芳香質(zhì)子結(jié)合,與環(huán)上及環(huán)外的烷基質(zhì)子結(jié)合較弱。另外,通過(guò)對(duì)化學(xué)位移變化和1HT1值分析可知,當(dāng)小檗堿濃度大于12mmol/L時(shí),結(jié)合達(dá)到了穩(wěn)態(tài),由此推測(cè)小檗堿與BSA的飽和濃度比為60∶1。文獻(xiàn)報(bào)道,蛋白與藥物的結(jié)合,其主要原因與血清白蛋白中的色氨酸殘基所形成的疏水腔有關(guān)。在小檗堿與BSA結(jié)合過(guò)程中,可能因?yàn)樾￠迚A中的芳香質(zhì)子更易通過(guò)疏水作用鑲嵌到BSA的疏水腔內(nèi)部而與色氨酸中的吲哚基團(tuán)結(jié)合。3.3小堿與bsa的關(guān)系在藥物與蛋白受體溶液中,蛋白受體(P)與藥物配體(L)及其生成的復(fù)合物(PL)存在動(dòng)態(tài)平衡。假設(shè)在一定藥物濃度范圍內(nèi)每個(gè)大分子上存在n個(gè)等同且獨(dú)立的藥物結(jié)合位點(diǎn),而且各個(gè)結(jié)合點(diǎn)具有相同的解離常數(shù)Kd,則當(dāng)結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí),根據(jù)Kd=[P][L]/[PL],[P]和[L]分別是游離態(tài)蛋白和藥物配體的濃度,[PL]是復(fù)合物的濃度)和核磁公式Aobs=AfXf+AbXb(Xb和Xf分別代表結(jié)合態(tài)和自由態(tài)配體的摩爾分?jǐn)?shù)),則存在以下公式:Aobs=Af+(Ab-Af){(nCP+CL+Kd)-[(nCP+CL+Kd)-4nCPCL]1/2}/2CL(2)其中,A代表NMR參數(shù)(化學(xué)位移、弛豫時(shí)間等),b和f分別代表結(jié)合態(tài)和游離態(tài),CP和CL分別是蛋白和藥物配體的總濃度。根據(jù)式(1)擬合曲線Aobs和CL得到解離常數(shù)Kd和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。本實(shí)驗(yàn)采用小檗堿自擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算解離常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。根據(jù)H-12的自擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算Kd和n。表3為2～32mmol/L小檗堿與0.2mmol/LBSA溶液所測(cè)得自擴(kuò)散系數(shù)。根據(jù)表3的數(shù)據(jù)擬合曲線Dobs和CL的函數(shù),得到Db和Df(其中Db為小檗堿濃度趨向于零時(shí)的自擴(kuò)散系數(shù),Df為小檗堿濃度趨向于無(wú)窮大時(shí)的值)。擬合得H-12的Db=6.764×10-10m2/s,Df=4.308×10-10m2/s。再根據(jù)式