大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展

大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展

大豆最早起源于中國。它不僅是人類最重要的石油和植物種類，也是一個(gè)重要的工業(yè)原料。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種新興的生物技術(shù)手段,在提高產(chǎn)量、抗性育種以及縮短育種周期等方面有著明顯的優(yōu)勢。早在1988年,McCabe和Hinchee分別用基因槍轟擊大豆未成熟胚生長點(diǎn)和用農(nóng)桿菌侵染大豆子葉節(jié)的方法獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株。筆者對大豆轉(zhuǎn)基因的研究與利用方面進(jìn)行了綜述,重點(diǎn)闡述了大豆轉(zhuǎn)基因的主要方法,分析了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的主要障礙及其可能的解決途徑,探討了轉(zhuǎn)基因大豆的生物安全性問題,最后指出了大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究方向。1超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法大豆轉(zhuǎn)基因的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激法、PEG法、超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等。其中,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法為大豆常用的轉(zhuǎn)基因方法。1.1大豆基因型的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),與植物基因轉(zhuǎn)化有關(guān)的有兩種類型:一為根癌農(nóng)桿菌,含有Ti質(zhì)粒,能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成冠癭瘤;二為發(fā)根農(nóng)桿菌,它含有Ri質(zhì)粒,能夠誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根。Ti質(zhì)粒(包括Ri質(zhì)粒)上有一段轉(zhuǎn)移DNA,在農(nóng)桿菌侵染植物時(shí),這段DNA可以插入到植物基因組中,使其攜帶的基因在植物中得以表達(dá)。由于T-DNA能夠進(jìn)行高頻率的轉(zhuǎn)移,而且Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒上可插入大到50kb的外源基因。因此,Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒就成為植物基因轉(zhuǎn)化的理想載體系統(tǒng)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法主要有整體植株接種共感染法和葉盤轉(zhuǎn)化法。1985年,Horsch等發(fā)明了葉盤轉(zhuǎn)化法,其操作方法是首先用打孔器從消毒葉片上取得葉圓片,亦稱之葉盤。目前,大豆農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化多采用的是改良葉盤法,外植體主要是子葉、下胚軸和子葉節(jié)等。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行大豆的轉(zhuǎn)基因研究是從野生型菌株開始的,Owens研究了大豆品種對農(nóng)桿菌的敏感性,Byrne等用21個(gè)大豆品種研究了大豆品種與農(nóng)桿菌間的關(guān)系。2002年,王罡等研究表明大豆基因型對根癌農(nóng)桿菌的敏感性,不同大豆基因型對根癌農(nóng)桿菌的敏感性存在顯著差異。我國學(xué)者王連錚等利用致瘤農(nóng)桿菌的15個(gè)菌系對2759個(gè)大豆品種的致瘤能力進(jìn)行了研究,篩選出7個(gè)致瘤能力較強(qiáng)的菌系。Kudirka等研究了大豆基因型、農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響。Fscciot等將SSU(1,5-二磷酸核酮糖融化酶)、OSU(章魚堿合成酶)和nptⅡ(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)的融合基因通過農(nóng)桿菌對大豆進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化,得到的抗性愈傷組織經(jīng)檢測后證明有融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)。Hinchee等(1988)首次通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株。Di等用含有BPMV外殼蛋白基因的農(nóng)桿菌侵染大豆,都獲得了轉(zhuǎn)基因植株。徐香玲等于1997年和1999年用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)分別將Bt(蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因)和菜豆幾丁質(zhì)酶基因?qū)氪蠖?得到轉(zhuǎn)化植株,經(jīng)檢測證明外源基因已整合到大豆基因組上。1999年蘇彥輝等和Zhao等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別得到轉(zhuǎn)Bt基因和bar基因的大豆轉(zhuǎn)化植株。2001年,趙桂蘭等將nptⅡ和Barnase基因?qū)氪蠖沟挠着吆妥尤~節(jié)中,篩選得到轉(zhuǎn)基因植株,PCR檢測證明nptⅡ和Barnase基因已整合到大豆基因組上,轉(zhuǎn)基因植株生物學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),花粉不育率達(dá)98%。姬月梅等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把與抗逆有關(guān)的小麥基因(TaNHX2)轉(zhuǎn)入大豆,經(jīng)檢測證明目的基因?qū)氩⒄系酱蠖够蚪M中。目前,從大豆成熟種子分離出的具有選擇性的子葉節(jié)作為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,獲得了較高的轉(zhuǎn)化率,能夠提高1.5倍,達(dá)到8.7%,這是大豆遺傳轉(zhuǎn)化率中較高的報(bào)道。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有技術(shù)簡單成熟,耗資少,可靠性高,轉(zhuǎn)化率相對較高,可以轉(zhuǎn)移大片段外源基因(>30kb),沒有明顯的基因重排現(xiàn)象,外源基因主要以單拷貝插入植物基因組等優(yōu)點(diǎn)。1.2金粉顆粒對小麥幼苗nptii基因表達(dá)的影響基因槍法又稱微彈轟擊法。這種技術(shù)是借用高壓氣體或高壓放電為動(dòng)力,用微粒對植物組織進(jìn)行轟擊而將其上的外源基因帶入到植物細(xì)胞內(nèi),優(yōu)點(diǎn)在于不受基因型和轟擊靶組織的限制。Klein等首次在洋蔥上對細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn),并在受體細(xì)胞中觀察到了病毒RNA的復(fù)制。隨后,他們還用這種技術(shù)將cat(chloram2phericolkacetyltrandferase)基因?qū)胙笫[表皮細(xì)胞,并從被轟擊的表皮組織的提取液中檢測到很高的cat活性。Christou等用基因槍法轉(zhuǎn)化未成熟胚,研究表明,金粉粒子深入到5~7層細(xì)胞,不同抗性愈傷插入nptII基因拷貝數(shù)不同,nptII酶活性不同。McCabe等(1988)以大豆芽分生組織為靶組織,經(jīng)基因槍轟擊獲得轉(zhuǎn)基因大豆,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,但都為嵌合體。Sato等以大豆組織的不同部位(未成熟胚的芽尖和長期增殖懸浮培養(yǎng)物)為靶組織進(jìn)行基因槍轟擊,GUS染色和組織切片結(jié)果表明,轟擊芽尖組織時(shí)GUS基因主要在細(xì)胞表層1~2層表達(dá);轟擊懸浮培養(yǎng)物GUS基因在表1層表達(dá),即轟擊的部位不同,被擊入細(xì)胞的深度也不同。Moore等對大豆子葉大小、轟擊壓力、基因型等對基因槍轉(zhuǎn)化的影響進(jìn)行研究,認(rèn)為GUS基因的表達(dá)是在表層或近表層,大豆未成熟子葉以4~5mm最好,轟擊壓力對GUS基因表達(dá)無影響,但在大豆基因型上存在顯著差異。1999年胡張華等在研究影響基因槍遺傳轉(zhuǎn)化因子時(shí)發(fā)現(xiàn),CaCl2濃度、氦氣壓力和受體狀態(tài)等對大豆轉(zhuǎn)化頻率有重要影響,在基因槍轟擊前24h,用5Gy輻射處理愈傷組織,轉(zhuǎn)化效率獲得了提高。后來,Hadi和Simmonds等又分別研究了多個(gè)質(zhì)?；旌限Z擊共轉(zhuǎn)化的效果,經(jīng)hygromycin抗性篩選和Southern雜交檢測,證明得到了共轉(zhuǎn)化的克隆和再生植株。王萍等在研究影響基因槍轉(zhuǎn)化效率時(shí)發(fā)現(xiàn),未成熟子葉被轟擊后在高滲培養(yǎng)基中停留的天數(shù)是影響大豆轉(zhuǎn)化率的主要因素之一。目前,外源目的基因的轉(zhuǎn)化僅有Bt基因和牛酪蛋白基因的成功報(bào)道,所用外植體為未成熟子葉或由未成熟子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性懸浮培養(yǎng)物(細(xì)胞團(tuán))。基因槍法能將外源基因轉(zhuǎn)移至幾乎所有的植物細(xì)胞、組織器官和原生質(zhì)體,對DNA的轉(zhuǎn)移過程與基因型的依賴性沒有任何生物限制。1.3利用抗卡那霉素進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)電激法利用植物原生質(zhì)體具有整合和表達(dá)外源DNA的能力,使細(xì)胞膜透性在電擊處理下發(fā)生變化,出現(xiàn)一些可逆性孔隙,和原生質(zhì)體膜直接接觸的DNA分子可進(jìn)入細(xì)胞,其中大部分DNA被細(xì)胞內(nèi)酶降解,一小部分DNA整合到核基因組中,并可穩(wěn)定遺傳。質(zhì)膜上可逆孔隙的大小、數(shù)量取決于電場強(qiáng)度、處理時(shí)間、溶液性質(zhì)細(xì)胞種類等。此方法優(yōu)點(diǎn)是可以一次轉(zhuǎn)化許多原生質(zhì)體,但須具備原生質(zhì)制備、培養(yǎng)和再生系統(tǒng)。李寶健等首次應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化,并用此法獲得了水稻轉(zhuǎn)基因植株。用電激法對大豆的遺傳轉(zhuǎn)化報(bào)道很少,Christou等用3個(gè)大豆品種研究電激條件,得到了抗卡那霉素的愈傷,并誘導(dǎo)生根;Dhir等以Clark63為材料,分別得到抗性芽和抗卡那霉素植株。由于原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜、難以掌握,應(yīng)用不廣泛。1.4超聲波處理對大豆胚性愈傷組織的影響超聲波基因轉(zhuǎn)化的基本原理是利用低聲強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用,擊穿細(xì)胞,使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。在進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)用超聲波處理外植體組織,使轉(zhuǎn)化的靶組織內(nèi)部或表面產(chǎn)生大量的微小傷口,有利于農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)。Trick等用掃描電鏡及光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),超聲波處理后使外植體表面及近表面產(chǎn)生大量的細(xì)小貫穿通道,農(nóng)桿菌易于與植物細(xì)胞接觸,從而促進(jìn)轉(zhuǎn)化過程。1998年Trick和Santarem等用SAAT法轉(zhuǎn)化大豆胚性懸浮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌能順利地進(jìn)入胚性愈傷組織內(nèi)部,并且發(fā)現(xiàn)超聲波處理材料2s時(shí),在27℃共培養(yǎng)3d,GUS表達(dá)高達(dá)36%,得到了含有外源基因的抗性愈傷。然而,未經(jīng)超聲波處理的子葉只有平均不到1%的GUS表達(dá)。FinerJJ等SAAT法轉(zhuǎn)GFP基因獲得相似的結(jié)果。1.5轉(zhuǎn)化自我變異特征花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道,將外源DNA導(dǎo)入受體植物基因組中?；ǚ酃芡ǖ婪ǖ幕驹硎侵参锸诜酆?花粉在雌蕊柱頭上萌發(fā)形成花粉管通道,使外源DNA或基因進(jìn)入胚囊,轉(zhuǎn)化受精卵或其前后的細(xì)胞(卵、早期胚細(xì)胞)而自然發(fā)育成種子,觀察其后代的變異,篩選出轉(zhuǎn)基因植物。1991年雷勃鈞等通過花粉管通道進(jìn)行了外源DNA的導(dǎo)入,轉(zhuǎn)化后代變異包括成熟期、株型、花色、種皮色、百粒重、蛋白質(zhì)含量等。張國棟等將玉米自交系和大豆品種的DNA導(dǎo)入另一大豆品種中,其后代的突變率分別為10.00%和5.32%,出現(xiàn)了種子蛋白含量、株高、莖粗、結(jié)莢習(xí)性、倒伏性、每株分枝數(shù)與莢數(shù)、粒數(shù)與百粒重等性狀變異。劉德璞在大豆中導(dǎo)入高抗花葉病的外源DNA,獲得了生育期、生長習(xí)性、株高、節(jié)數(shù)、分枝數(shù)等傾向供體的變異性狀,且對SMV的抗性也得到了提高。胡張華等將反義PEP基因轉(zhuǎn)入浙春3號大豆品種中獲得再生植株,并得到PCR檢測結(jié)果。徐香玲等將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入大豆栽培品種中獲得再生植株,分子雜交證明了幾丁質(zhì)酶基因已轉(zhuǎn)入大豆中。用這些方法可以轉(zhuǎn)移單基因孟德爾遺傳的性狀和多基因數(shù)量性狀。該方法的優(yōu)點(diǎn)有:(1)操作簡單,無需細(xì)胞、原生質(zhì)體等組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程,可在大田、盆栽或溫室中進(jìn)行。(2)應(yīng)用廣泛,單胚珠和多胚珠的單、雙子葉植物均可;育種時(shí)間短,在自花授粉的基礎(chǔ)上只有部分外源DNA片段進(jìn)入受體基因組,比較穩(wěn)定。(3)適應(yīng)于重組DNA分子的導(dǎo)入。但是,該方法的缺點(diǎn)也很突出,如轉(zhuǎn)化效率非常低、可重復(fù)性不高等,因此,限制了其廣泛的應(yīng)用。1.6peg誘導(dǎo)法PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鳥氨酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子。聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)多聚L-鳥氨酸等都是細(xì)胞融合劑。PEG分子量為1.5~6.0kDa,水溶性,pH從4.6~6.8,因多聚程度不同而異。它可以使細(xì)胞膜之間或使DNA與膜形成分子橋,促使相互間的接觸和粘連。另外,有實(shí)驗(yàn)證實(shí),PEG是通過引起膜表面電荷的紊亂,干擾細(xì)胞間的識別,而有利于細(xì)胞膜間的融合和外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。因此,稱之為PEG誘導(dǎo)法。PEG直接轉(zhuǎn)化方法對禾本科作物有重要作用,已經(jīng)在水稻、高粱和小麥等重要糧食作物都獲得了轉(zhuǎn)基因植株。大豆的PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因在衛(wèi)志明和南相日的研究中報(bào)道。Lin用PEG法把nptII和cat基因?qū)氪蠖乖|(zhì)中,6h后檢測到CAT酶活性,并獲得有CAT酶活性的抗性愈傷組織。這種方法的成功率很低,所以應(yīng)用受到限制。2大豆遺傳轉(zhuǎn)化的主要障礙和可能解決2.1大豆再生植株的研究進(jìn)展大豆轉(zhuǎn)基因是否能獲得成功,再生體系的建立是必要的前提和基礎(chǔ)。大豆再生體系建立主要工作是大豆的組織培養(yǎng)研究,大豆的組織培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)60年代,但各種外植體的組織培養(yǎng)與再生植株都十分困難。目前,在大豆的組織培養(yǎng)中應(yīng)用較多的體系主要有兩個(gè),即大豆子葉節(jié)經(jīng)器官發(fā)生誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生再生植株和大豆未成熟子葉經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)體細(xì)胞胚萌發(fā)植株。前者再生率高,易于培養(yǎng),但用于遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)易產(chǎn)生嵌合體,給后期的篩選工作帶來許多麻煩。未成熟子葉的體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑雖然可以克服嵌合體現(xiàn)象,但其對農(nóng)桿菌較敏感,進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)易受到傷害,轉(zhuǎn)化率低。直到進(jìn)入20世紀(jì)80年代我國此項(xiàng)工作才有報(bào)道。因此,進(jìn)一步研究和優(yōu)化大豆組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化體系,建立新的、高效穩(wěn)定的大豆組織培養(yǎng)體系是十分必要的。2.2雙價(jià)抗蟲或抗病基因從已經(jīng)得到的大豆轉(zhuǎn)基因植株看,多為組織培養(yǎng)能力較好,宜于再生的大豆品種,而生產(chǎn)上大面積栽培的品種因再生能力差,很少被用作受體,這對轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)一步在生產(chǎn)上利用受到很大的限制。因此,應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)優(yōu)化大豆組織培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)研究工作。從所轉(zhuǎn)化的外源目的基因看,主要是轉(zhuǎn)抗除草劑基因、Bt基因和幾丁質(zhì)酶基因等抗蟲、抗病的單個(gè)基因。在植物轉(zhuǎn)基因研究中,一個(gè)潛在的嚴(yán)重問題是害蟲和病原體對單基因可能會(huì)產(chǎn)生抗性或耐受性。在基因構(gòu)建時(shí)應(yīng)采用組織專一性啟動(dòng)子或化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子,或者同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)基因,如轉(zhuǎn)抗蟲基因時(shí),可同時(shí)使用2個(gè)以上Bt基因轉(zhuǎn)化農(nóng)作物或聯(lián)合Bt基因和其他類型的抗蟲基因(CpTI或Gna)。昆蟲對2種獨(dú)立殺蟲劑同時(shí)產(chǎn)生耐受性基本上是不可能的。因此,使用雙價(jià)抗蟲(或抗病)基因可能是今后大豆轉(zhuǎn)基因的一個(gè)方向。目前轉(zhuǎn)入大豆具有實(shí)用價(jià)值的農(nóng)藝性狀的基因非常少。到目前為止,通過改進(jìn)大豆的選擇和植株再生、改造Vir基因構(gòu)件、優(yōu)化可疑大豆表型的鑒定和篩選方法,通過在培養(yǎng)基內(nèi)附加vir區(qū)基因的化學(xué)誘導(dǎo)劑增強(qiáng)農(nóng)桿菌的致毒力,通過利用超聲波、轟擊和真空抽濾等方法增加外植體的創(chuàng)傷,大豆的轉(zhuǎn)化頻率有所提高,但獲得轉(zhuǎn)基因大豆的效率還相當(dāng)?shù)?有必要研發(fā)更有效的技術(shù)方法進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率。3環(huán)境安全性評價(jià)中的基因污染問題隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化生產(chǎn)的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)在食品生產(chǎn)中應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大。大量的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品己經(jīng)直接或間接地制作為人們消費(fèi)的食品,轉(zhuǎn)基因食品的份額在傳統(tǒng)食品市場中的比例不斷加大,逐步走上人們的餐桌,進(jìn)入人們的食物鏈。轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠提高糧食產(chǎn)量,解決世界人口增加與糧食短缺的矛盾,改善食品品質(zhì),滿足人們提高生活質(zhì)量的要求。但是轉(zhuǎn)基因也帶來了諸多新的問題,如目的基因漂移可能產(chǎn)生“超級雜草”、“超級病毒”;抗除草劑作物可能使農(nóng)民加大除草劑的用量,而加重對生態(tài)環(huán)境的污染。環(huán)境安全性評價(jià)的核心問題是轉(zhuǎn)基因植物釋放到田間后,是否會(huì)將所轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到野生植物中,是否會(huì)破壞自然生態(tài)環(huán)境,打破原有生物種群的動(dòng)態(tài)平衡。人們對其引起的擔(dān)心主要表現(xiàn)在以下3方面:(1)雜草化。釋放到環(huán)境中的轉(zhuǎn)基因植物通過花粉進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移,可能將一些抗蟲、抗病、抗除草劑或?qū)Νh(huán)境脅迫具有耐性的基因轉(zhuǎn)移給野生親緣種或者雜草,而雜草一旦獲得轉(zhuǎn)基因生物的抗逆性,就將變成超級雜草,從而威脅其他作物的正常生長和生存。(2)轉(zhuǎn)基因生物對非目標(biāo)生物的影響。釋放到環(huán)境中的抗蟲和抗病類轉(zhuǎn)基因植物,除對害蟲和病菌致毒外,對環(huán)境中的許多有益生物也會(huì)產(chǎn)生直接或者間接的不利影響,甚至?xí)?dǎo)致一些有益生物的死亡。(3)對生物多樣性和生態(tài)環(huán)境的影響。通過人工對動(dòng)物、植物和微生物甚至人的基因進(jìn)行相互轉(zhuǎn)移,具有普通物種不具備的優(yōu)勢征,若釋放到環(huán)境,會(huì)改變物種間的競爭關(guān)系,破壞原有自然生態(tài)的平衡,導(dǎo)致物種滅絕和生物多樣性的喪失。轉(zhuǎn)基因生物易通