水牛角熱提液的生物活性評價(jià)研究

水牛角熱提液的生物活性評價(jià)研究

conububali是?？苿游颾ubali和科林動物的角。性味苦、寒,具清熱、解毒、涼血、定驚作用,臨床用于溫病高熱、神昏譫語、發(fā)斑發(fā)疹、吐血衄血、驚風(fēng)癲狂等癥,療效顯著?，F(xiàn)代研究表明,水牛角水煎液能協(xié)同戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時(shí)間,且具有明顯的解熱作用。水牛角水解物具有快速止血作用。20世紀(jì)80年代,為尋找犀、廣角替代資源,國家行業(yè)部門對多種角類進(jìn)行了比較性研究與評價(jià),結(jié)果認(rèn)為水牛角具有相似和確切的功效,并確定了以水牛角之管狀部分磅片、水煎、取煎液濃縮后加入經(jīng)微粉化的角尖粉混合制粒得“水牛角濃縮粉”,收載入中華人民共和國藥典(1977年版),并代用犀、廣角用作醫(yī)藥工業(yè)和臨床調(diào)劑,取得了良好療效。30年來關(guān)于客觀反映水牛角功效的物質(zhì)基礎(chǔ)和生物效應(yīng)關(guān)系尚缺少科學(xué)系統(tǒng)的評價(jià)研究。本課題組在國家科技項(xiàng)目資助下對犀角、廣角、羚羊角及其替代資源水牛角、牦牛角等八種角類藥材開展了較為系統(tǒng)的與臨床功效相關(guān)的生物活性和物質(zhì)基礎(chǔ)評價(jià)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)水牛角的水溶性蛋白及肽類、游離氨基酸、宏微量元素組成與犀、廣角相似,僅含量存在一定差異。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對水牛角主要藥效學(xué)進(jìn)行了評價(jià),并對水牛角解熱活性物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了初步分析。1實(shí)驗(yàn)材料1.1r旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和mc-3l型電腦在線密度儀分析天平(MettlerToledo千分之一電子天平);DW-2型調(diào)溫電熱碗(江蘇通州市張芝鎮(zhèn)決心化工電器廠);BuchiR200Rotavapor旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士);MC-3L型電腦數(shù)字式溫度計(jì)(歐姆龍大連有限公司生產(chǎn));ZIL-2型程控自主活動箱(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn),內(nèi)徑0.9~1.1mm,壁厚0.10~0.15mm);AmershamAKTABasicPH/C100層析系統(tǒng)(美國通用);BeckmanAllegra64RCentrifuge高速冷凍離心機(jī)(美國);Millipore-Q純水器(美國);VirTis冷凍干燥機(jī)(美國)。1.2化學(xué)試劑及試劑水牛角購于淮安市碼頭鎮(zhèn)屠宰場,經(jīng)段金廒博士鑒定為為牛科動物水牛BubalusbubalisLinnaeus的角),符合2005版《中華人民共和國藥典》項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。艾司唑侖片(常州四藥制藥有限公司,白色片劑,1mg/片);氨甲苯酸片(國營張家港市制藥廠,白色片劑,0.25g/片);阿司匹林腸溶片(南京白敬宇制藥有限公司);干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司生產(chǎn));考馬斯亮藍(lán)G-250(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公);牛血清白蛋白對照品(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。1.3動物小鼠(KM種,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司);大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1樣品的制備2.1.1牛角粉的制備水牛角曬干后除去角塞,經(jīng)江蘇省盱眙縣中藥飲片廠加工粉碎后過400目篩,得水牛角粉。2.1.2提取水牛角熱提液制備水牛角熱提液制備水牛角熱提液制備水牛角熱提液制備水牛角熱提液制備水牛角熱提液見表2稱取水牛角粉適量,加蒸餾水回流微沸提取3次,第1次加14倍量水提取10h,第2次加12倍量水提取8h,第3次加12倍量水提取6h,提取液合并后60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.55g(生藥)/mL,得水牛角熱提液,置4℃保存?zhèn)溆?經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測定其中蛋白質(zhì)含量約為3.213mg/mL。2.1.3蛋白質(zhì)含量測定稱取水牛角粉適量,加蒸餾水4℃攪拌冷浸3次,每次加10倍量水冷浸8h,冷浸液合并后55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.55g(生藥)/mL,得水牛角冷浸液,置4℃保存?zhèn)溆?經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測定其中蛋白質(zhì)含量約為0.266mg/mL。2.2牛角綜合藥物評價(jià)的實(shí)驗(yàn)2.2.1大鼠的前測模型選健康大鼠,雄性,體重180~200g,編號,稱重。測肛溫2次,選用40只體溫范圍36~38.5℃,且體溫波動小于0.3℃者,隨機(jī)分為5組,分別為空白對照組、熱提液組、冷浸液組、水牛角粉組、陽性藥組(阿司匹林片),每組8只。造模前測體溫作為“基礎(chǔ)體溫”。大鼠的劑量為:2.75g(生藥)/kg。各組大鼠均背部皮下注射20%酵母-NS溶液10mL/kg,造成發(fā)熱模型。造模后6h,每組大鼠均分別灌胃給藥,給藥后的0、0.5、1、1.5、2、3h復(fù)測大鼠肛溫。以各時(shí)間點(diǎn)的體溫升高值作組間比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。2.2.2小鼠的分組及用量取小鼠50只,禁食12h,體重20g左右,分為5組,分別為空白對照組、熱提液組、冷浸液組、水牛角粉組、陽性藥組(艾司唑侖片),每組10只,雌雄各半。小鼠的劑量為:5.5g(生藥)/kg。每只小鼠在程控自主活動箱放置1min后,記錄其2min內(nèi)的活動次數(shù)。2.2.3動物分組及劑量取小鼠50只,禁食12h,體重20g左右,分成5組,分別為空白對照組、熱提液組、冷浸液組、水牛角粉組、陽性藥組(氨苯甲酸片),每組10只,雌雄各半。小鼠的劑量為:5.5g(生藥)/kg。連續(xù)對小鼠灌胃給藥3d,d3給藥1h后,用毛細(xì)管插入小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢取血,達(dá)5cm血柱,每隔15s折斷毛細(xì)管一小截,檢查有無血凝絲出現(xiàn),記錄從毛細(xì)管采血到出現(xiàn)血凝絲的時(shí)間,為凝血時(shí)間。2.3牛角熱提取物的熱激活部位篩選試驗(yàn)2.3.1角熱提液劑量組1.0g采用大鼠解熱實(shí)驗(yàn),將選取的健康大鼠隨機(jī)分為5組,分別為空白對照組、水牛角熱提液低劑量組(1.1g生藥/mL)、水牛角熱提液中劑量組(2.2g生藥/mL)、水牛角熱提液高劑量組(4.4g生藥/mL)和水牛角粉組。以各時(shí)間點(diǎn)的體溫升高值作組間比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。2.3.2a合成ph/c100層析系統(tǒng)凝膠柱層析法:SephadexG25柱(40cm×2.8cm),AKTABasicPH/C100層析系統(tǒng),水為流動相,流速2mL/min,紫外檢測器在215nm,260nm,280nm處檢測。用該法將水牛角熱提液分離為A、B、C3個(gè)部位,并通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)測定3個(gè)部位的相對分子量范圍。2.3.3水牛角熱提液的熱提液熱提液樣品的制備采用大鼠解熱實(shí)驗(yàn),將選取的健康大鼠隨機(jī)分為5組,分別為空白對照組、水牛角熱提液A部位、B部位、C部位、陽性藥組(阿司匹林片),劑量采用熱提液解熱最佳劑量。以各時(shí)間點(diǎn)的體溫絕對值和體溫升高值作組間比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。3結(jié)果3.1牛角綜合分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1熱提液和冷浸液給藥后的熱作用表1結(jié)果表明水牛角粉在給藥后1h(P<0.05),1.5h(P<0.01)有解熱作用,熱提液在給藥后1.5h(P<0.05)有解熱作用,而冷浸液給藥后3h內(nèi)無明顯解熱作用。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),同等劑量下,水牛角粉的解熱作用最強(qiáng),水牛角熱提液的解熱作用次之,而冷浸液的解熱作用不確切。3.1.2水牛角粉、熱提液、冷浸液給藥前后自發(fā)活動次數(shù)結(jié)果見表2。由表2可看出水牛角粉、熱提液、冷浸液給藥后小鼠自發(fā)活動次數(shù)與對照組比較無顯著性差異(P>0.05),而水牛角粉、熱提液、冷浸液給藥前后自發(fā)活動次數(shù)減少值與對照組比較有顯著性差異(P<0.05),從以上結(jié)果看出,水牛角粉、熱提液、冷浸液均具有良好的鎮(zhèn)靜作用。3.1.3小鼠出血時(shí)間和凝血作用結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明水牛角粉、熱提液、冷浸液均能縮短小鼠出血時(shí)間,具有顯著的凝血作用,而水牛角粉和熱提液的凝血作用(P<0.01)強(qiáng)于冷浸液的凝血作用(P<0.05)。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1水牛角熱提液給藥后體溫增增率ld50由表4可看出,水牛角熱提液低劑量組(1.1g生藥/mL)給藥后體溫增減值在0.5、1.5、2h與空白組比有較顯著性差異(P<0.01,P<0.05);水牛角熱提液中劑量組(2.2g生藥/mL)給藥后體溫增減值在0.5、1、1.5、3h與空白組比有較顯著性差異(P<0.01,P<0.05);水牛角熱提液高劑量組(4.4g生藥/mL)給藥后體溫增減值在0.5、1、1.5、3h與空白組比有較顯著性差異(P<0.01)。根據(jù)解熱作用持續(xù)時(shí)間和體溫降低幅度值確定,水牛角中劑量為解熱最佳劑量。3.2.2相對分子量范圍按照分子量大小將水牛角熱提液分為A部位、B部位和C部位,分別表示大分子量部位、中分子量部位和小分子量部位,相對分子量范圍分別為4100Da~10kDa、3700Da~6500Da與3500Da~5800Da。3.2.3水牛角熱提液a部位對大鼠體溫的影響結(jié)果見表5、表6。表5、表6結(jié)果表明,水牛角熱提液C部位給藥后2h大鼠體溫絕對值與對照組比較有顯著性差異(P<0.05);水牛角熱提液A部位給藥后1h、1.5h、3h大鼠體溫增減值與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。分析結(jié)果表明,水牛角熱提液A部位和C部位具有解熱作用。4水牛角的基礎(chǔ)研究本文對水牛角藥兒學(xué)評價(jià)研究結(jié)果表明水牛角粉、水牛角熱提液具有顯著的解熱、鎮(zhèn)靜、促凝血活性;冷浸液解熱作用不明顯。據(jù)文獻(xiàn)分析可知,水牛解中所含特殊氨基酸如?；撬?、谷氨酸等可能與鎮(zhèn)靜、凝血活性相關(guān);所含微量元素如Ca2+、Mg2+可能與鎮(zhèn)靜、解熱活性相關(guān)。水牛角熱提液解熱活性評價(jià)與物質(zhì)基礎(chǔ)研究表明,水牛角熱提液中大分子量部位與小分子量部位活性顯著,其分子量范圍介于3500Da~10kDa之間,提示主要成分可能為對熱穩(wěn)定的多肽、氨基酸等物質(zhì),其進(jìn)一步分離純化、活血性追蹤及作用機(jī)制的單明有待深入研究。同時(shí),利用生物技術(shù)克隆具有生物活性的蛋白及多肽物質(zhì)也是具有發(fā)展前景的方向之一。水牛角的中醫(yī)臨床傳統(tǒng)功效之一為清熱涼血,本文藥效學(xué)評價(jià)表明水牛角具有顯著的促凝血活性,但促凝血的效應(yīng)指標(biāo)是否體現(xiàn)