烤煙漂浮育苗菌PGPR菌肥在烤煙漂浮育苗中的應(yīng)用

烤煙漂浮育苗菌PGPR菌肥在烤煙漂浮育苗中的應(yīng)用

與中國(guó)傳統(tǒng)的育苗技術(shù)相比，懸浮式泰榮苗有許多優(yōu)點(diǎn)，可以減少育苗和移栽的工作量，操作管理（施肥、溫濕度控制、病蟲害防治、葉片、衛(wèi)生等）。均勻、可靠的卷煙、高移植成活率和高的抗逆性。因此,自20世紀(jì)90年代初從美國(guó)引進(jìn)以來(lái),在我國(guó)迅速得到推廣應(yīng)用。然而,烤煙漂浮育苗還有許多有待改進(jìn)之處,比如新基質(zhì)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用及組成比例優(yōu)化,營(yíng)養(yǎng)液的組成及比例優(yōu)化以降低成本、促進(jìn)煙苗生長(zhǎng)發(fā)育;漂浮育苗病害的防治;煙苗剪葉、練苗技術(shù),噴施壯苗素、光合細(xì)菌以培育壯苗等。植物根際促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,簡(jiǎn)稱PGPR)菌肥在烤煙漂浮育苗中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。PGPR是指能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量的植物根際細(xì)菌。自從1978年Burr等首先報(bào)道馬鈴薯上PGPR以來(lái),國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)包括熒光假單孢菌、芽孢桿菌、根瘤菌、沙雷氏菌等20多個(gè)種屬的根際細(xì)菌具有防病促生的潛能。這些PGPR主要通過(guò)固氮作用、解磷作用、解鉀作用、抗生作用、產(chǎn)生植物激素和植物修復(fù)作用等促進(jìn)植物生長(zhǎng)。目前,我國(guó)推廣的菌肥主要是融有益微生物、有機(jī)肥、無(wú)機(jī)肥的生物復(fù)肥,所用的菌種主要是解磷菌、解鉀菌和固氮菌。菌肥在玉米、小麥和水稻等農(nóng)作物及蔬菜生產(chǎn)中應(yīng)用較多,在烤煙生產(chǎn)中應(yīng)用還較少,且都是用于烤煙大田栽培,更大的問(wèn)題在于烤煙生產(chǎn)所使用的菌肥中的微生物并非分離自煙草根際,在一定程度上也影響了應(yīng)用效果,因?yàn)榉蛛x自植物根際的土著PGPR對(duì)植物的促生作用最好。烤煙漂浮育苗使用的種子和基質(zhì)均經(jīng)過(guò)消毒,種子萌發(fā)長(zhǎng)出的煙苗根系不能及時(shí)由PGPR定殖形成菌膜,這對(duì)煙苗的生長(zhǎng)和抗病性有不利的影響。本研究應(yīng)用分離自烤煙根際的抗生菌制成菌肥,拌入烤煙漂浮育苗的基質(zhì)中,試驗(yàn)證明可有效地促進(jìn)烤煙種子萌發(fā)和煙苗生長(zhǎng)。1材料和方法1.1土壤煙地的分布于烤煙采收期在環(huán)神農(nóng)架煙區(qū)3個(gè)縣區(qū)不同植煙土壤類型不同植煙年限的煙地選取健康煙株采集根際土樣,分別是興山縣石嶺村黃壤土煙地,植煙17年;神農(nóng)架林區(qū)八角廟村黃灰包土煙地,植煙1年;房縣西坪村黃沙壤土煙地,植煙2年。采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板稀釋分離烤煙根際細(xì)菌,純化后進(jìn)行對(duì)煙草病原菌的拮抗作用、解磷作用、解鉀作用和固氮作用試驗(yàn),從中篩選烤煙高效促生菌。1.2赤星病病原菌鏈格孢菌煙草病原菌選用對(duì)烤煙生產(chǎn)危害嚴(yán)重的3種病害的病原菌,分別是煙草角斑病病原菌丁香假單胞桿菌角斑致病變種(Pseudomonassyringaepv.angulata)、青枯病病原菌青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum(Smith)和赤星病病原菌鏈格孢菌(Alterariaalternata(Fries)Keissler),均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院蔣士君博士惠贈(zèng)。對(duì)前2種病原菌的拮抗作用試驗(yàn)應(yīng)用采用濾紙片法,設(shè)3次重復(fù),30℃培養(yǎng)2d,觀察浸有分離的烤煙根際細(xì)菌菌懸液的濾紙片周圍有無(wú)抑菌圈,計(jì)算抑菌圈直徑與濾紙片直徑的比值。對(duì)赤星病病原菌的拮抗作用采用含細(xì)菌培養(yǎng)法,以不含細(xì)菌懸浮液的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基為對(duì)照,重復(fù)3次,28℃恒溫培養(yǎng)5d,檢查煙草赤星病菌生長(zhǎng)情況,并測(cè)量菌落直徑,按下式計(jì)算抑菌率:抑菌率=(1?接入拮抗菌平板中病原菌菌落的平均直徑對(duì)照平板中病原菌菌落的平均直徑)(1-接入拮抗菌平板中病原菌菌落的平均直徑對(duì)照平板中病原菌菌落的平均直徑)×100%1.3細(xì)菌培養(yǎng)基的利用將分離的烤煙根際細(xì)菌分別接種在解磷細(xì)菌培養(yǎng)基、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基和阿須貝培養(yǎng)基平板中,培養(yǎng)基配方見(jiàn)文獻(xiàn),28℃培養(yǎng)3~7d,在解磷細(xì)菌培養(yǎng)基平板上能形成明顯解磷圈的菌落記作有解磷作用;在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基可形成透明的光滑的油滴狀的菌落,而且菌落顏色始終不變記作有解鉀作用;在阿須貝培養(yǎng)基平板中可形成光滑半透明粘稠并產(chǎn)生褐色色素的菌落記作具有固氮作用。對(duì)具有解磷作用、解鉀作用或固氮作用的菌株分別采用液體解磷細(xì)菌培養(yǎng)基、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基和阿須貝培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng),測(cè)定其解磷能力、解鉀能力或固氮酶活力。1.4草炭的制備篩選得到的高效促生菌分別經(jīng)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng),28℃200rpm培養(yǎng)28~48h。草炭涼干到含水量10%~20%,粉碎至60~80目,按每袋0.5kg裝袋,0.1MPa高壓滅菌2h,取出冷卻備用。將菌懸液注入草炭中,0.5kg草炭注入100mL,揉搓塑料袋使菌懸液和草炭混合均勻,置于30℃培養(yǎng)2~7d。經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板稀釋計(jì)數(shù),每克菌肥含菌數(shù)不低于1億個(gè)為合格。1.5菌肥的使用與管理試驗(yàn)在十堰市房縣湖北中煙試驗(yàn)站進(jìn)行,漂浮育苗品種為云煙87,由湖北煙科所提供,育苗基質(zhì)由涼山州綠源漂浮育苗器材有限公司提供,主要成分是草炭、膨脹珍珠巖和蛭石。分別取菌肥與育苗基質(zhì)混合均勻,菌肥的用量是基質(zhì)的1%。每種菌肥重復(fù)3盤,每盤120穴,常規(guī)管理,調(diào)查發(fā)芽率、成苗素質(zhì)、移栽后的生長(zhǎng)情況等。以僅含有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的草炭伴育苗基質(zhì)為對(duì)照。2結(jié)果與分析2.1赤星病病原菌抗菌材料檢測(cè)3個(gè)烤煙根際土樣經(jīng)平板稀釋分離共挑取67株菌落形態(tài)不同的菌株,純化后采用濾紙片法測(cè)定對(duì)煙草角斑病病原菌和青枯病病原菌的拮抗作用,采用含細(xì)菌培養(yǎng)法測(cè)定對(duì)赤星病病原菌的拮抗作用,對(duì)該3種煙草病原菌的拮抗作用較強(qiáng)的14株分離株列于表1。從表1可以看出,對(duì)青枯病原菌平板拮抗作用最強(qiáng)的是菌株B26,其次是A03和A41等5株菌株。對(duì)角斑病病原菌平板拮抗作用最強(qiáng)的菌株是A03、A20和A41,其次是A38和B04等8株菌株。對(duì)赤星病病原菌平板拮抗作用最強(qiáng)的菌株是A03、A15和C11,其次是A20和A38等9株菌株。2.2芽孢桿菌屬bacillus菌株的固氮作用將對(duì)3種煙草病原菌的拮抗作用較強(qiáng)的14株烤煙根際細(xì)菌分離株分別接種于解磷細(xì)菌培養(yǎng)基、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基和阿須貝培養(yǎng)基平板,測(cè)定其是否具有解磷作用、解鉀作用或固氮作用,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出,A03、A41、B26和C11四株菌株不具有解磷作用、解鉀作用或固氮作用,初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株;A15、B23、C33和B04四株菌株具有解磷作用;A20、A38、C64和B10四株菌株具有解鉀作用;C09和C10二株菌株具有固氮作用。綜合考量烤煙根際細(xì)菌分離株對(duì)煙草病原菌的拮抗作用以及是否具有解磷作用、解鉀作用或固氮作用,選擇A03和B04二株菌株擴(kuò)大培養(yǎng)制成菌肥,用于烤煙漂浮育苗試驗(yàn)。2.3利用煙草根際推廣細(xì)菌肥料促進(jìn)煙臺(tái)漂浮栽培2.3.1種子發(fā)芽率測(cè)定A03菌株對(duì)3種煙草病原菌都有較強(qiáng)的拮抗作用,B04菌株不僅對(duì)3種煙草病原菌的拮抗作用較強(qiáng),而且在解磷細(xì)菌培養(yǎng)基平板中形成的解磷圈較大,搖瓶培養(yǎng)后測(cè)定其解磷能力,培養(yǎng)液上清中P含量最高,達(dá)到4.37mg/L,選擇此二菌株制成菌肥,按1%的比例與育苗基質(zhì)混合,試驗(yàn)對(duì)烤煙漂浮育苗的應(yīng)用效果。播種后27d和39d各處理種子發(fā)芽率調(diào)查結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn),播種27d,菌株A03菌肥處理育苗種子發(fā)芽率是90.55%,分別比對(duì)照和菌株B04菌肥處理提高53.1%和68.9%,均達(dá)到顯著水平(p<0.05)。播種后39d,菌株A03菌肥處理育苗種子發(fā)芽率是96.39%,比對(duì)照和菌株B04菌肥處理分別提高5.5%和3.6%。菌株B04菌肥處理種子發(fā)芽率在播種后27d低于對(duì)照,但到播種后39d則比對(duì)照提高1.8%(圖1)。2.3.2菌肥處理對(duì)煙苗的生長(zhǎng)播種后60d成苗期對(duì)漂浮育苗煙苗農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查,五點(diǎn)取樣法從每個(gè)處理的各個(gè)重復(fù)中抽取10株煙苗測(cè)量莖高、莖粗、莖干重和根鮮重,結(jié)果見(jiàn)表3。菌株A03菌肥處理煙苗莖高、莖粗、莖干重、根鮮重和根長(zhǎng)分別比對(duì)照提高51.1%、19.8%、84.4%、50.3%和53.7%,達(dá)到極顯著(p<0.01)或顯著水平(p<0.05),葉色深綠,而對(duì)照為淺綠。菌株B04菌肥處理煙苗莖高、莖粗、莖干重、根鮮重和根長(zhǎng)分別比對(duì)照提高24.2%、0.8%、71.9%、32.0%和34.7%,莖干重、根鮮重和根長(zhǎng)差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)(表3)。2.4成活率、長(zhǎng)、成活率漂浮育苗時(shí)用菌肥處理的煙苗和對(duì)照煙苗移栽后成活率均為100%,長(zhǎng)勢(shì)均良好。菌肥處理的煙苗移栽后均未感染任何病害,而對(duì)照普通花葉病發(fā)病率為3.9%,角斑病發(fā)病率為14.8%。3pgpr和b06在煙苗抗病力中的應(yīng)用從烤煙根際分離得到2株細(xì)菌菌株A03和B04,平板測(cè)定對(duì)3種煙草病害煙草角斑病、青枯病和赤星病的病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用,其中B04菌株具有解磷能力。將該二菌株擴(kuò)大培養(yǎng)制成菌肥應(yīng)用于烤煙漂浮育苗,可顯著提高種子發(fā)芽率和成苗素質(zhì),成苗移栽成活率為100%,對(duì)各種病害有較強(qiáng)的抗性。表明菌株A03和B04對(duì)烤煙具有較強(qiáng)的促生作用,是烤煙根際促生菌(PGPR)。施用微生物培育壯苗已有報(bào)道,方敦煌等將篩選自烤煙根際的對(duì)煙草黑脛病菌有拮抗作用的細(xì)菌菌懸液灌根接種于營(yíng)養(yǎng)液培育的煙苗,對(duì)煙草黑脛病有較高的防效,并明顯促進(jìn)煙苗的最大葉面積和地上部鮮重。吳小平等在烤煙漂浮育苗過(guò)程中葉面噴施光合細(xì)菌菌液,可明顯提高煙苗的葉綠素含量和成苗素質(zhì)。在烤煙漂浮育苗的基質(zhì)中添加PGPR菌肥以培育壯苗尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)B04菌株的促生作用是否是由于其能夠作用于基質(zhì)使基質(zhì)中的無(wú)效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為有效態(tài)磷還需進(jìn)一步研究。菌株A03和B04的促生作用表現(xiàn)出對(duì)煙草病原菌的平板拮抗作用和大田抗性,其機(jī)理應(yīng)當(dāng)與其率先定殖于烤煙根系,優(yōu)先占領(lǐng)根際有關(guān),是否產(chǎn)生抗生素、鐵載體、誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性或產(chǎn)生HCN等,拮抗根際的病原菌或非寄生性根際有害微生物(deleteriousrhizospheremicroorganisms,DRM0)來(lái)保護(hù)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育,還有待深入研究。PGPR的另一個(gè)促生作用表現(xiàn)為產(chǎn)生植物激素生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素,以及降低植物的乙烯水平。乙烯產(chǎn)生于植物根部,可加快植物對(duì)生物的或非生物的環(huán)境條件的變化的反應(yīng)。高濃度的乙烯抑制植物根的伸長(zhǎng),導(dǎo)致植物生長(zhǎng)不正常。許多PGPR可分泌1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸鹽(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)脫氨酶即A