降解菌hn36對煙苗莖尖和頂葉二氯喹啉酸的降解動態(tài)

降解菌hn36對煙苗莖尖和頂葉二氯喹啉酸的降解動態(tài)

二氯彌勒草是一種具有特殊的選擇性雜草活性物質(zhì)的脫希爾雜草（guson，1998）。對于在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)前田種植的二氯彌勒草劑殘留在土壤中，降低速度緩慢，導(dǎo)致晚草的生長畸形，嚴(yán)重制約了植煙區(qū)葉片的生產(chǎn)，嚴(yán)重影響了葉片的產(chǎn)量和質(zhì)量。微生物技術(shù)的抗旱性土壤中的二氯彌勒草劑為恢復(fù)污染土壤提供了一種新的環(huán)境保護(hù)方法。沈標(biāo)等(2002)、陳澤鵬等(2004)、胡江等(2005)、楊基峰等(2006)、湯洪等(2008)已報道有關(guān)除草劑污染土壤生態(tài)環(huán)境及其修復(fù)方面的研究,Zabaloy等(2010)研究了微生物降解菌在土壤中對2,4-D的降解效果,但是關(guān)于二氯喹啉酸污染土壤的修復(fù)報道較少。陳澤鵬等(2007)研究結(jié)果證明施用活性炭對土壤中殘留二氯喹啉酸致煙草畸形癥狀有一定的減輕作用,但不能使煙草恢復(fù)正常生長。劉華山等(2010)的研究結(jié)果表明,在二氯喹啉酸脅迫下,噴施不同濃度的硝普鈉(SNP)能減少煙葉活性氧的產(chǎn)生和丙二醛的積累,對煙苗保護(hù)酶系統(tǒng)具有修復(fù)作用。目前尚無關(guān)于利用微生物修復(fù)受二氯喹啉酸污染土壤的最佳技術(shù)報道,對受害的煙草莖尖和葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響更無報道。本文在含二氯喹啉酸的土壤中加入降解菌HN36后,在電鏡下觀察煙株細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,利用高效液相色譜測定土壤中二氯喹啉酸濃度,采用微生物技術(shù)降解二氯喹啉酸,旨在為土壤健康質(zhì)量的修復(fù)和促進(jìn)稻煙輪作地區(qū)煙葉生產(chǎn)的發(fā)展提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1性添加劑nicotiagman二氯喹啉酸降解菌HN36(博德特氏菌Bordetellasp.)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物實驗室提供;50%二氯喹啉酸可濕性粉劑由江蘇綠利來股份有限公司生產(chǎn);供試普通煙(Nicotianatabacum)品種為‘K326’;盆栽試驗用的土取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū),為砂壤土,pH為7.97,含有機(jī)質(zhì)12.93g·kg–1,全氮0.87g·kg–1,全磷0.42g·kg–1,堿解氮57.43mg·kg–1,速效磷27.75mg·kg–1,速效鉀164.15mg·kg–1。1.2方法1.2.1煙苗的處理及樣品的制備試驗共設(shè)3個處理:(1)健康煙株(不施二氯喹啉酸和降解菌);(2)受害煙株(施二氯喹啉酸,有效濃度為0.085mg·kg–1;不施降解菌);(3)修復(fù)煙株(施二氯喹啉酸,有效濃度為0.085mg·kg–1;降解菌HN36數(shù)量為3×1010個·g–1干土)。將水、二氯喹啉酸溶液及加入降解菌的二氯喹啉酸溶液噴灑到3kg過篩(直徑2mm)風(fēng)干的土壤上,拌勻后裝入高15cm、直徑為20cm的塑料盆中,每個處理重復(fù)3次,保持土壤含水量為田間最大持水量的60%。將生長健壯一致的五葉期煙苗移栽到盆中,待煙株長至8片葉時取樣在電鏡下進(jìn)行觀察。分別取煙株的莖尖、頂葉和中部葉(自上而下第4片葉)進(jìn)行處理。葉片取自中脈附近的葉肉組織用刀片切成1mm×1mm的小片。樣品用戊二醛-鋨酸雙重固定法固定。材料先經(jīng)4%戊二醛固定,經(jīng)過磷酸緩沖液沖冼后,再用1%四氧化鋨固定。磷酸緩沖液沖洗,系列丙酮30%→50%→70%→80%→90%進(jìn)行脫水,梯度滲透液滲透后,用Epon812環(huán)氧樹脂包埋,鉆石刀切成超薄切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色,在JEM-100SX型透射電鏡(JEOLLtd.,Akishima,Japan)下觀察并拍照。1.2.2土壤二氯羥基酸含量測定土壤中加入二氯喹啉酸的有效濃度為0.085mg·kg–1(商品推薦量為0.375kg·hm–2,代號為A)同時加入不同量降解菌設(shè)4個處理:T0:A+0個·g–1干土(CK),T1:A+3×108個·g–1干土,T2:A+3×109個·g–1干土,T3:A+3×1010個·g–1干土。將二氯喹啉酸和降解菌溶液拌到20kg過篩(2mm)的風(fēng)干土中拌勻后裝入高45cm、直徑為35cm的塑料盆中,每處理重復(fù)3次,室溫下放置。保持土壤含水量為田間最大持水量的60%,處理后15、30、45和60天取0–15cm土層的土測定二氯喹啉酸含量,在中國科學(xué)院南京土壤研究所采用ProminenceUFLCXR型高效液相色譜儀(Shimadzu,Tokyo,Japan)測定。色譜操作條件:(1)選150mm×4.6mm(內(nèi)徑)不銹鋼色譜柱,內(nèi)裝ODS-(2)填充物,粒徑5μm;流動相:甲醇+水+冰乙酸=85+15+0.1(V);流量:0.8mL·min–1;檢測波長:238nm;進(jìn)樣體積:10μL。二氯喹啉酸降解率(%)=(C0–Ct)/C0×100%;C0:土壤中初始二氯喹啉酸濃度(mg·kg–1),Ct:t時刻取樣時土壤中二氯喹啉酸濃度(mg·kg–1)1.2.3抗硝泮hn36對二氯丁基二胺酸群落質(zhì)量的影響試驗處理同1.2.1,在煙葉成熟時,按王瑞新(2003)的方法,測定煙葉中常規(guī)的化學(xué)成分。2結(jié)果2.1葉綠細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)在電鏡下觀察到健康煙株莖尖細(xì)胞能正常生長和分化,細(xì)胞內(nèi)有大量的細(xì)胞核和葉綠體等細(xì)胞器,結(jié)構(gòu)完整清晰,葉綠體結(jié)構(gòu)完整,片層清晰質(zhì)膜緊貼在細(xì)胞壁上(圖1A、1D)。受二氯喹啉酸危害的煙株莖尖細(xì)胞受到破壞,細(xì)胞內(nèi)大量的細(xì)胞器溶解,出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象。葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變形,基粒片層模糊(圖1B、1E)。施用二氯喹啉酸降解菌的煙株莖尖細(xì)胞中,細(xì)胞器增多,細(xì)胞內(nèi)大部分細(xì)胞正常,葉綠體所含淀粉粒數(shù)目增多,基粒片層較清晰(圖1C、1F)。受害狀況得到一定程度的修復(fù)。2.2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)壁分離在電鏡下觀察到健康煙株頂葉細(xì)胞器緊貼細(xì)胞壁排列,葉綠體結(jié)構(gòu)完整,葉綠體由雙層外被膜包圍,外膜清晰完整。葉綠體內(nèi)含有較少的淀粉粒(圖2A、2D)。受害的煙株頂葉細(xì)胞內(nèi)發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象,葉綠體結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞,甚至發(fā)生變形,葉綠體外膜受到破壞,細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生溶解(圖2B、2E)。修復(fù)煙株的頂葉細(xì)胞受到破壞的程度減輕,質(zhì)體緊貼細(xì)胞壁排列,細(xì)胞器得到修復(fù),基粒片層結(jié)構(gòu)雖然還有些模糊,但比受害煙株有明顯的修復(fù)(圖2C、2F)。2.3基粒片層結(jié)構(gòu)在電鏡下觀察到健康煙株中部葉葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰,細(xì)胞壁光滑,細(xì)胞之間有較小的間隙,質(zhì)膜緊貼在細(xì)胞壁上,內(nèi)部片層系統(tǒng)發(fā)育良好,基粒片層結(jié)構(gòu)清晰,葉綠體內(nèi)含有淀粉粒(圖3A、3D)。受害煙株中部葉片細(xì)胞中葉綠體形態(tài)變化較小,葉綠體結(jié)構(gòu)完整,片層結(jié)構(gòu)模糊(圖3B、3E)。修復(fù)的煙株中部葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,片層結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞器形態(tài)變化較小(圖3C、3F)。2.4氯喹啉酸降解率由表1可知,隨著處理時間的延長,土壤中二氯喹啉酸的濃度呈下降趨勢而降解率逐漸升高。到第45天時,加入的降解菌處理的土壤中二氯喹啉酸降解率均高于未加降解菌的處理,且降解率隨著菌種量的增加而提高。到第60天時,當(dāng)加入降解菌數(shù)量為3×109個·g–1干土和3×1010個·g–1干土?xí)r,二氯喹啉酸濃度未檢測出,而對照仍殘留50%以上的二氯喹啉酸,表明降解率隨著菌種量的增加而提高,其中菌種量為3×1010個·g–1干土(T3)時降解效果最佳。2.5總糖、還原糖、淀粉和煙堿含量由表2可以看出,在受二氯喹啉酸危害的煙葉成熟時,總糖、還原糖、淀粉和鉀含量均明顯低于對照,而總氮和煙堿含量明顯高于對照;但是加入降解菌處理的修復(fù)煙葉化學(xué)成分與對照基本近似,表明修復(fù)效果明顯。3氯喹啉酸對煙草超微結(jié)構(gòu)的影響在稻煙輪作區(qū),由于水稻田施用的二氯喹啉酸降解慢,殘留期長,對后茬煙草產(chǎn)生危害。陳澤鵬等(2004)研究表明二氯喹啉酸可導(dǎo)致煙草出現(xiàn)畸形生長,新葉向葉背面內(nèi)卷皺縮,并逐漸發(fā)展成線狀葉型,對產(chǎn)量和品質(zhì)都有很大的影響。研究證明二氯喹啉酸對煙草的危害還表現(xiàn)在煙株莖尖和葉片超微結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞,其中莖尖和上部葉受害程度大于中下部葉(圖1B、1E;圖2B、2E;圖3B、3E),這和于紅麗等(2010)關(guān)于銅脅迫下小麥(Triticumaestivum)幼苗細(xì)胞不同部位或不同細(xì)胞器的傷害程度存在一定差異的研究結(jié)果基本相似。商文靜等(2007)、張景云等(2010)和宇克莉等(2010)的研究表明細(xì)胞器及膜系統(tǒng)會受到不同程度的破壞特別是葉綠體、線粒體及細(xì)胞核等超微結(jié)構(gòu)都發(fā)生不同程度的變化。湯洪(2008)等研究結(jié)果也表明,草甘膦處理煙草對煙葉細(xì)胞中葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)有破壞作用,本研究結(jié)果表明,二氯喹啉酸脅迫下的煙株莖尖和葉片細(xì)胞中葉綠體及膜系統(tǒng)等都受到破壞,與已有研究結(jié)果相一致。左濤等(2010)研究表明,向土壤中施用二氯喹啉酸降解菌不僅對受害煙株的保護(hù)酶系統(tǒng)有一定修復(fù)作用,而且對受害煙株的莖尖和葉片的超微結(jié)構(gòu)也有明顯的修復(fù)作用(圖1C、1F;圖2C、2F;圖3C、3F)。二氯喹啉酸在酸性土壤中分解緩慢,陳澤鵬等(2007)的研究表明,土壤中施用生石灰對受害煙苗有一定的修復(fù)作用,可能是通過提高土壤的pH值從而促進(jìn)二氯喹啉酸分解而實現(xiàn)的,但由于土壤是一個大的緩沖系統(tǒng),施用生石灰調(diào)節(jié)土壤pH有一定限度,因此施用生石灰對受害煙株修復(fù)雖然有一定作用,但不能修復(fù)正常。Zhang等(2006)篩選分離出一株菌株DDV-1(Ochrobactrumsp.)以敵敵畏作為唯一碳源,能夠修復(fù)土壤的污染。本研究結(jié)果表明,土壤中施用二氯喹啉酸降解菌,能增強(qiáng)土壤微生物活性,受害煙株修復(fù)效果更明顯,可能是基于降解菌能加速二氯喹啉酸的降解,當(dāng)降解菌降解60天后,土壤中已檢測不出二氯喹啉酸,而未加降解菌處理的土壤中,尚殘留有50%以上的二氯喹