煙草硝酸還原酶的激活與抑制作用

煙草硝酸還原酶的激活與抑制作用

亞硝酸鹽是許多植物的主要氮來源。硝酸根離子在硝酸還原酶作用下,經(jīng)硝酸還原過程先轉(zhuǎn)變?yōu)榘?再與碳水化合物化合形成各種氨基酸,構(gòu)成植物體的各種含氮組分。由植物同化的硝酸鹽大約是2×1013?kg/a,比生物固氮的速率大100倍。因此,硝酸鹽的同化作用在植物氮代謝中具有重要的意義。植物中硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氨先是硝酸鹽獲得電子還原成亞硝酸鹽,再由硝酸還原酶催化。NR是這個(gè)過程的起始酶,也是限速酶,在植物氮素代謝中處于關(guān)鍵地位。煙草中含氮化合物(蛋白質(zhì)、游離氨基酸、煙堿和硝酸鹽等)對(duì)煙草的質(zhì)量和吸煙者的健康都有重要的影響。因此,研究煙草中NR具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。1材料和方法1.1tps-ms/ms法磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硝酸鉀、亞硝酸鈉、EDTA、磺胺、1-萘胺、鹽酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等均為分析純;去離子水,半胱氨酸,NADH為生化試劑。721分光光度計(jì),pHS-2C酸度計(jì),FA1104電子天平,各種規(guī)格Finnpipette可調(diào)式移液器;SHZ-D水循環(huán)式真空泵,HH-S型水浴鍋,多功能食物攪拌器,冷凍離心機(jī),超聲波清洗器以及常規(guī)化學(xué)分析用玻璃儀器。1.2實(shí)驗(yàn)方法和步驟1.2.1制定標(biāo)準(zhǔn)no2曲線按照文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行。1.2.2酶液的制備和分離除誘導(dǎo)NR活性實(shí)驗(yàn)外,其余實(shí)驗(yàn)所用粗酶液按下述方法制備:取移栽30d(研究不同葉齡NR活性實(shí)驗(yàn)除外)后的煙苗倒數(shù)第3片完全展開葉,先用自來水沖洗,濾紙吸干后,分別用純凈水、去離子水淋洗,再用濾紙吸干,用不銹鋼剪刀剪成小塊,加入pH值8.5的50mmol/L磷酸鹽緩沖液(內(nèi)含5mmol/LEDTA和10mmol/L半胱氨酸),勻漿后在超聲波儀上處理5min(冰浴),然后置于6層紗布過濾,濾液在4000r/min條件下離心15min,棄沉淀,所得濾液即為酶液,立即使用。1.2.3nr活力測定取12支試管,分別加入pH值5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0濃度0.05mol/L磷酸鹽緩沖液2.0ml,濃度0.2mol/L?KNO3溶液0.5ml和濃度0.2mol/L?NADH1滴,酶液0.1ml,水浴鍋上25℃保溫30min,然后向每支試管加入濃度1%磺胺和0.2%1-萘胺各1.0ml,搖勻,25℃保溫30min,用721型分光光度計(jì)測定520nm波長下吸光度A,并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到相應(yīng)的NO2-含量,計(jì)算NR活力。NR活力以NO2-[μml/(g.h)]表示(比較時(shí)直接用吸光度表示)。每個(gè)水平設(shè)2個(gè)平行。1.2.4pv活力測定取10支試管,分別加入pH值7.0濃度0.05mol/L磷酸鹽緩沖液2.0ml,濃度0.2mol/LKNO3溶液0.5ml,濃度0.2mol?NADH50μl,酶液0.1ml,再依次加入PVP100、120、140、160、180mg,水浴鍋上25℃保溫30min,然后按照上述方法測定與計(jì)算NR活力大小。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行,結(jié)果取平均值。1.2.5kno3溶液活力測定取10支試管,分別加入pH值7.0濃度0.05mol/L磷酸鹽緩沖液2.0ml/L,濃度0.2mol/LNADH50μl,酶液0.1ml,再加入KNO3溶液使KNO3溶液濃度分別為:10、30、50、73、90、100mmol/L,在水浴鍋上25℃保溫30min,用同樣方法測定與計(jì)算NR活力大小。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行。1.2.6nr活力測定取6支試管,分別加入pH值7.0濃度0.05mol/L磷酸鹽緩沖液2.0ml,濃度0.2mol/LKNO3溶液0.5ml,酶液0.1ml,再依次加入NADH至濃度分別為0、0.010、0.020mg/ml,水浴鍋上25℃保溫30min,用同樣方法測定與計(jì)算NR活力大小。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行,平均值作為測定值。1.2.7相同植物葉片nr活力測定將煙葉采收后,插入濃度0.2mol/LKNO3溶液中,另一份插入去離子水中,作為對(duì)照。為避免光強(qiáng)度變化的影響,它們始終置于相同的日光燈下。分別經(jīng)1、2、3、4、5、6h誘導(dǎo)后,用前述方法制備粗酶液。再取0.1ml粗酶液加入到下列混合液中:pH值7.0濃度0.05mol/L磷酸鹽緩沖液2.0ml,濃度0.2mol/LKNO3溶液0.5ml,濃度0.2mol/L?NADH1滴,水浴鍋上25℃保溫30min,用同樣方法測定與計(jì)算NR活力大小。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行。1.2.8不同葉間隔內(nèi)的ri活力研究分別取移栽后20、30、50天葉齡的煙苗,對(duì)其NR的活力按前述方法進(jìn)行測定。2結(jié)果與討論2.1ph值對(duì)nr活性的影響圖1顯示,從pH值5.5開始,隨著pH值的增加,NR活性隨之增加。pH值7.0時(shí),活力達(dá)到最高,其后隨著pH值的增加,活性反而降低。2.2pv用量對(duì)nr活力的影響(圖2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PVP有明顯保護(hù)酶活力的作用,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),NR活力是隨著PVP用量的增加而不斷增加的。但當(dāng)濃度達(dá)到80mg/ml后,效果不明顯。另外,將這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于NR的提取與純化時(shí)發(fā)現(xiàn),PVP用量較高時(shí),會(huì)使提取液變得粘稠,不利于攪拌、過濾等操作。2.3kno3濃度對(duì)nr活性的影響圖3KNO3是NR作用的直接底物,它對(duì)酶的活力有顯著的影響。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),這種影響不符合米氏方程。2.4nadh對(duì)nr活性的影響(圖4)NADH是煙草NR的輔基,在NR對(duì)KNO3進(jìn)行還原的酶促反應(yīng)中,起著提供電子的作用,從這一點(diǎn)看,似乎NADH始終對(duì)NR的活力有促進(jìn)作用。但研究結(jié)果表明,NADH濃度較高時(shí),反而抑制NR的活性。Solomonson認(rèn)為,在NO3-還原為NO2-時(shí),NR活性中心的M04+被氧化為M06+,然后可能通過電子傳遞再使M06+還原為M04+。在過多NADH存在下,含鉬活性中心可能被還原為不能參與NO3-還原的穩(wěn)定的M03+,因而鈍化了酶。2.5kno3對(duì)煙草nr活性的影響圖5顯示,在相同時(shí)間內(nèi),經(jīng)KNO3誘導(dǎo)的煙葉中NR活性比未誘導(dǎo)煙葉高很多。未經(jīng)誘導(dǎo)的煙葉NR活力在處理后4h達(dá)到最高值,而經(jīng)過KNO3誘導(dǎo)的煙葉,其NR活力在處理后2h就已達(dá)到最大值,這也表明,經(jīng)過KNO3誘導(dǎo),使得酶活性的滯后期有所提前。在酶活性達(dá)到最大值后,NR活力開始衰減,但衰減的速率不一樣。未經(jīng)KNO3誘導(dǎo)的煙葉NR活力衰減速率約是經(jīng)誘導(dǎo)煙葉的2倍。2.6影響nr活性的因素(圖6)高等植物(包括煙草)的NR活性受多種因子的調(diào)節(jié),除了酶的合成和降解外,穩(wěn)定因子和NR的失活蛋白都能調(diào)節(jié)NR的活性。由于