枳實消痞丸對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜fas表達的影響

枳實消痞丸對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜fas表達的影響

幽門螺桿菌（hp）是世界上最常見的感染原因之一。大量資料顯示Hp感染與胃、十二指腸疾病關(guān)系極為密切。在多數(shù)國家,超過90%的十二指腸潰瘍患者和將近70%的胃潰瘍患者伴有Hp感染。目前Hp作為慢性活動性胃炎主要的發(fā)病原因已被認識,并且被認為與胃癌的發(fā)生有密切關(guān)系。1994年,Hp已被世界衛(wèi)生組織定為Ⅰ類致癌物。臨床上已肯定慢性活動性胃炎患者的胃黏膜中Hp的檢出率可高達90%以上,經(jīng)Hp敏感的抗菌藥物治療后,在Hp消失的同時伴有胃黏膜組織學(xué)的改善及癥狀的好轉(zhuǎn)。因此根除Hp是治療慢性胃炎、消化性潰瘍和預(yù)防胃癌的重要環(huán)節(jié)。在西藥治療Hp感染方面,雖然目前國際上推崇的三聯(lián)療法具有較高的根除率,但由于耐藥株的出現(xiàn),導(dǎo)致治療失敗率增加。另外,三聯(lián)治療可出現(xiàn)惡心、嘔吐、食欲減退及腹瀉等不同程度的副作用,據(jù)報道有5%~20%的患者因不能耐受而停止治療。中醫(yī)藥在治療幽門螺旋桿菌感染相關(guān)性慢性胃炎方面取得了一定進展,但也存在著側(cè)重解毒祛邪,或者單方面輔助正氣,忽視益氣散滯、扶正去邪的傾向。根據(jù)中醫(yī)理論,我們認為“氣虛標實”是幽門螺旋桿菌感染相關(guān)性慢性胃病的主要病機。鑒此,本實驗以Hp感染的BALB/c小鼠為研究對象,以胃黏膜損傷程度、細胞凋亡指數(shù)和Fas蛋白表達水平為指標,評價枳實消痞丸配合西藥的治療效果,并與單用西藥、中藥組進行比較,以期尋找更有效的根除Hp治療方案。1材料表面1.1小鼠精子pf54只無特殊病原菌(Specificpathogenfree,SPF)雌性BALB/c小鼠,7~8周齡,體重26~31g,由河南省實驗動物中心提供,許可證號SYXK(豫)2005-0012。動物實驗在鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院無菌動物房進行,飼養(yǎng)和實驗條件符合SPF級動物要求。1.2大學(xué)醫(yī)學(xué)視角實驗用Hp菌株為國際標準菌株SS1(Sydneystrain1)(獲贈于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院)。將保存于-80℃的Hp菌株SS1涂布于布氏瓊脂培養(yǎng)基,在一定濕度(98%)、微需氧(5%O2,8%CO2,80%N2)、37℃培養(yǎng)72h后,從菌落形態(tài)、尿素酶試驗、硝酸鹽試驗、革蘭染色等方面對Hp感染的有無及其程度進行鑒定。1.3試劑與檢測試劑盒枳實消痞丸按照原方劑量(枳實、干姜、厚樸、黃連、姜半夏、人參、茯苓、白術(shù)、制甘草、麥芽)水煎提取,甲硝唑片(山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司,批號050528),枸櫞酸鉍鉀膠囊(鄭州韓都藥業(yè)集團有限公司,批號050316),阿莫西林膠囊(廣州白云山制藥有限公司,批號4050345),凋亡指數(shù)(AI)檢測試劑盒、Fas檢測試劑盒、Bcl-2檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司(批號200409),胃幽門螺桿菌診斷pH指示劑法診斷試劑盒(福建三強生物化工有限公司,批號20051001)1.4儀器無菌操作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市華北實驗儀器有限公司)、光學(xué)顯微鏡(Olympus-CH20)。2方法2.1胃黏膜組織病理學(xué)檢測取7~8周齡雌性BALB/c小鼠,禁食不禁水12h后,ig5%NaHCO30.2mL/只,30min后ig1×109CFU·L-1的Hp菌液0.5mL,6h后予以投食,隔日1次,連續(xù)3次。造模后1,2周,禁食12h后各處死造模小鼠2只,取全胃,沿大彎剪開,用生理鹽水漂洗。取1/2胃黏膜組織行快速尿素酶試驗及幽門螺桿菌培養(yǎng)(接種時直接將胃黏液面與布氏肉湯瓊脂培養(yǎng)基接觸,涂抹),另取1/2胃組織用10%甲醛溶液固定、石蠟包埋切片后行HE染色。根據(jù)“中華醫(yī)學(xué)會第二屆全國Hp專題研討會”確定的Hp科研診斷標準,尿素酶試驗、細菌培養(yǎng)、HE染色檢測陽性者,為造模成功。2.2阿莫西林、枳實消菌丸、模型組、空白對照組出現(xiàn)所有實行生活的罪犯所有飲食見表1取Hp造模成功小鼠40只,隨機分為中西藥聯(lián)用組(枳實消痞丸24.6g·kg-1·d-1+西藥三聯(lián))、中藥組(枳實消痞丸24.6g·kg-1·d-1)、西藥組(西藥三聯(lián),即枸櫞酸鉍鉀72.08mg·kg-1·d-1、阿莫西林300.33mg·kg-1·d-1、甲硝唑150.17mg·kg-1·d-1)、模型組、空白對照組(正常飲食),連續(xù)給藥14d。2.3提交材料末次投藥后,禁食12h,頸椎脫臼法處死小鼠,取全胃,沿大彎剪開,取1/2胃組織用4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋制片。2.4指標報告2.4.1組織病理學(xué)檢測胃黏膜切片,HE染色,光鏡下觀察病理組織學(xué)改變。參考Eric法,計算胃黏膜損傷指數(shù)(lesionindex,LI):胃黏膜淺層未見明顯病變?yōu)?分;病變限黏膜淺層上1/3、上皮細胞變性、黏膜充血水腫、少許出血糜爛、黏膜淺層炎性細胞浸潤者為1分;病變達黏膜淺層上2/3,明顯點片狀出血糜爛,黏膜層及黏膜下層中性白細胞浸潤為2分;病變累及黏膜整個淺層為3分。2.4.2細胞培養(yǎng)與細胞凋亡采用TUNEL技術(shù)進行檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水處理后,加入含有TdT和DIG-d-UTP的標記液,20μL于濕盒中37℃標記2h,洗凈后,加入生物素化抗地高辛抗體,37℃反應(yīng)30min,洗凈后加SABC10μL,37℃反應(yīng)30min,洗凈、脫水、封片,顯微鏡觀察。結(jié)果判定:細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,即凋亡的細胞。選取染色典型的5個以上連續(xù)視野,人工計數(shù)1000個以上胃黏膜細胞中陽性細胞總數(shù),計算陽性細胞百分率即凋亡指數(shù)。2.4.3免疫組化法檢測cas-fas抗體的表達采用免疫組織化學(xué)染色方法(SABC法)進行觀察,切片常規(guī)脫蠟、水化后,滴加5%BSA封閉液,室溫反應(yīng)20min,滴加兔抗Fas抗體,4℃反應(yīng)12h,PBS洗凈后滴加適量山羊抗兔IgG,37℃孵育20min。PBS洗凈后室溫DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染、脫水、封片。結(jié)果判定:選取染色典型的5個以上連續(xù)視野,人工計數(shù)1000個以上胃黏膜細胞中陽性細胞總數(shù),計算陽性細胞的百分率。細胞膜或漿著色,呈棕黃色者為陽性反應(yīng)。2.5統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件計量資料以表示,比較用方差分析,P<0.05為差異有顯著性。3結(jié)果3.1損傷程度對比模型組的胃黏膜損傷與空白組相比有明顯差異(p<0.01),各治療組損傷程度均有明顯改善,3個用藥組的改善程度依次為中西藥組>西藥組>中藥組,中西藥組優(yōu)于中藥組(P<0.05),見表1。3.2各組以次對比與正常組相比,胃黏膜細胞凋亡指數(shù)(AI)自中西藥組、西藥組、中藥組、模型組以次呈增高趨勢。給藥3個組與模型組比有顯著降低(P<0.05,P<0.01),中西藥合用組比中藥、西藥單用組作用強(P<0.01,P<0.05),見表2。3.3各組fas蛋白表達的比較模型組與正常組相比,Fas蛋白的表達顯著增高(P<0.01),給藥3個組Fas蛋白的表達均有明顯降低(P<0.01,P<0.05),中西藥組的抑制作用強于西藥組(P<0.01)。見表3。4植物的免疫作用Hp感染導(dǎo)致的慢性胃炎、胃潰瘍等屬于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”、“心下痞”等范疇,病變部位在胃,但與肝、脾等密切相關(guān)。若外邪犯胃、飲食傷胃、情志不暢皆可導(dǎo)致脾虛不運、胃失和降而致病,其基本病機多以脾胃虛弱、寒熱互結(jié)、氣機阻滯者為常見。脾胃虛弱、運化失司、升降失調(diào),可導(dǎo)致氣滯血瘀、寒熱互結(jié),為Hp的附著、定植、繁殖提供了客觀條件,脾虛是疾病產(chǎn)生的根本,扶正祛邪是治療疾病的基本法則。枳實消痞丸出自《蘭室秘藏》,由枳實、厚樸、黃連、半夏、干姜、人參、茯苓、白術(shù)、麥芽、炙甘草組成,具有行氣消痞、健脾和胃之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明:枳實對幽門螺旋桿菌有顯著的殺滅作用;厚樸具有影響胃腸活動、抗菌、抗病毒等作用;黨參含皂苷及黨參堿,能增加消化液的分泌,調(diào)節(jié)胃腸運動,可助消化;白術(shù)含蒼術(shù)醇和蒼術(shù)酮,為健脾要藥,可促進胃腸消化液的分泌助消化,對各種細菌有抑菌作用;半夏、黃連、干姜、麥芽等具有抑制胃酸分泌、收斂保護胃腸黏膜的作用。臨床觀察表明,枳實消痞丸配合西藥三聯(lián)對改善臨床癥狀、促使胃黏膜修復(fù)以及清除Hp等方面都明顯優(yōu)于西藥單用與中藥單用組,且毒副作用較輕,是治療Hp感染相關(guān)性胃炎的理想組合。近年來發(fā)現(xiàn)Hp感染與胃黏膜上皮細胞凋亡之間有密切的聯(lián)系,Moss等首先利用脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(TUNEL)技術(shù)對Hp感染與胃黏膜上皮細胞凋亡間的關(guān)系進行研究,發(fā)現(xiàn)Hp陽性的患者胃黏膜TUNEL標記的陽性細胞明顯增加,而Hp陰性對照組凋亡細胞極少,提示Hp感染可導(dǎo)致胃黏膜上皮細胞凋亡蛋白的表達異常。本研究發(fā)現(xiàn),Hp感染小鼠在給予中藥、西藥及中西藥治療后,胃黏膜上皮細胞AI明顯降低,中西藥聯(lián)用組又優(yōu)于西藥組和中藥組,表明Hp感染可以誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞的凋亡,中西藥聯(lián)合應(yīng)用較單獨應(yīng)用西藥、中藥治療具有更好的抑制胃黏膜上皮細胞凋亡的效果。Fas抗原廣泛存在于多種組織