木霉對棉花枯萎病的防治效果研究

木霉對棉花枯萎病的防治效果研究

棉花萎縮是棉花生產(chǎn)中的一種毀滅性疾病。這是由頭孢菌的異質(zhì)結(jié)（f.sp.vasinfens）引起的一種維持。可通過土壤傳播，難以控制。如果發(fā)生輕微事故，棉花產(chǎn)量和纖維質(zhì)量就會下降，嚴重病例可能會導(dǎo)致絕產(chǎn)。20世紀80年代以來,由于一批抗病品種的育成,使該病害在重病區(qū)得到一定程度的控制,但在一些地區(qū)仍然有枯萎病的危害與蔓延。對棉花枯萎病的防治主要是利用抗病品種,但抗病品種存在選育年限長、抗性單一等問題。傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑防治,在抑制病原菌的同時,也殺死有益的拮抗微生物,而且長期使用已造成病原菌產(chǎn)生抗藥性,并污染環(huán)境。因此,生物防治作為綜合防治的一個重要環(huán)節(jié),越來越多地受到人們關(guān)注。木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界中普遍存在并有豐富資源的拮抗微生物,它具有廣譜性、適應(yīng)性強和多機制性的特點。木霉對核盤菌、立枯絲核菌、棉花黃萎病菌、紋枯病菌、稻瘟菌、枯萎病菌等均有抑制作用。木霉菌競爭作用強、能產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌類物質(zhì)、具有重寄生作用等。木霉不僅對病原微生物有拮抗作用,而且能直接作用于植物,促進其萌發(fā)、生長和開花,且其本身受外界干擾影響小,由此在植病生物防治中占有重要地位,具有廣闊的應(yīng)用前景。合理利用具有潛力的拮抗微生物的先決條件是了解其寄生過程、機理及防病效果。本試驗研究俄羅斯綠色木霉(T.viride)菌株GY20對棉花枯萎病菌的拮抗、重寄生現(xiàn)象及在溫室盆栽條件下對棉花枯萎病的防治效果,旨在為木霉菌在棉花枯萎病田間生物防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1的藥物制劑綠色木霉(TrichodermavirideGY20,以下簡稱GY20)購于俄羅斯國家毒物制劑研究所;病原菌為棉花枯萎病菌-尖孢鐮刀菌萎蔫?；?Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectumF12,以下簡稱F12),該菌株由鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。1.2測試方法1.2.1高效抑菌試驗接種參照肖燁等的方法,用直徑為5mm的打孔器切取培養(yǎng)5d同質(zhì)等量的GY20和棉花枯萎病菌的菌絲塊接種于PDA平板上各距中心2cm處同一直線的兩點上,同時設(shè)只接種木霉或病原菌作為對照,每處理5個重復(fù),于25℃恒溫培養(yǎng),定期檢查抑制效果,5d后測量正常生長棉花病原菌菌落半徑和被抑制菌落生長半徑,計算抑菌率。抑菌率=(1-被抑制處菌落生長半徑/正常生長菌落半徑)×100%。1.2.2顯微照片的拍攝在平皿對峙培養(yǎng)時,當(dāng)兩菌落交接后,在交接部位或病原菌菌落內(nèi)部挑取菌絲在顯微鏡下觀察兩者的相互作用,用Olypus攝影顯微鏡(BX41-32P02)拍攝顯微照片。1.2.3棉花枯病菌種的制備在兩個培養(yǎng)皿內(nèi)倒上PDA培養(yǎng)基制成平板,同時分別接種同質(zhì)等量的GY20菌絲塊和棉花枯萎病原菌的菌絲塊,然后將2個培養(yǎng)皿對扣,中間夾1層滅菌透氣玻璃紙,用封口膜密封。以僅接種棉花枯萎病原菌為對照,每處理5個重復(fù)。將接種病原菌的培養(yǎng)皿底朝上放置,在25℃下培養(yǎng),5d后測量棉花枯萎病病原菌的菌落半徑,計算抑菌率。1.2.5棉苗接種后觀察棉花種子保濕培養(yǎng),露白后播種,待棉花長出第2~3片真葉后開始接種。把配制于PD中培養(yǎng)1周的GY20菌和棉花枯萎病原菌的孢子懸浮液并調(diào)整孢子數(shù)量為5×106個/mL。將孢子懸浮液注入根圍土壤中,病原菌接種前用剪刀破壞根系,每穴40mL。共分3個處理和1個對照:(1)CK,不接菌,傷根處理,加無菌水;(2)只接種GY20;(3)只接種F12;(4)先接種GY20,在上面用無菌土覆蓋2~3cm,3d后接種F12,重復(fù)3次。棉苗接種后每天觀察病害的發(fā)生情況,待病情穩(wěn)定后調(diào)查發(fā)病率,按以下標(biāo)準(zhǔn)記載發(fā)病級別。0級:生長正常;1級:葉片或莖萎蔫面積由下而上占全株的1/4或不足1/4;2級:葉片或莖萎蔫面積由下而上占全株的1/2;3級:葉片或莖萎蔫面積由下而上占全株的3/4;4級:全株葉全部萎蔫或整株死亡。病情指數(shù)計算公式:病情指數(shù)=100×∑(各級病株數(shù)×該級代表值)/(總株數(shù)×最高病級代表值),相對防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。1.3數(shù)據(jù)分析采用MicrosoftExcel2003整理數(shù)據(jù)、作圖,數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。2結(jié)果與分析2.1棉花枯渙病fps2菌落的生長半徑對峙培養(yǎng)結(jié)果表明,木霉菌株GY20對棉花枯萎病原菌有明顯的抑制作用(圖1),對峙培養(yǎng)5d開始出現(xiàn)抑菌圈,同時木霉GY20開始包圍或覆蓋棉花枯萎病原菌F12菌落,使其面積不再擴展,棉花枯萎病F12菌落的生長半徑明顯低于對照生長半徑。之后,F12菌落開始逐漸萎縮,木霉菌絲進一步擴展侵入F12菌落,最終F12菌落全部萎縮,整個平皿被GY20所占據(jù),并大量產(chǎn)生綠色木霉孢子。由表1可知,平皿對峙培養(yǎng)5d后,分別測量對照組及處理棉花枯萎病F12的生長半徑,得GY20對F12的平均抑制率為71.33%。以上結(jié)果表明,供試俄羅斯木霉菌GY20對棉花枯萎病F12菌落生長具有很好的抑制作用。2.2木霉菌gy20生長特性對峙培養(yǎng)顯微觀察結(jié)果(圖2)表明,正常生長的棉花枯萎病菌F12菌絲,生長細長、光滑而均勻,有分枝;而木霉菌GY20與棉花枯萎病菌F12交界處,F12菌絲的頂端及中間形成大量泡狀體,整個菌絲變?yōu)榇闋?細胞壁變得通透,細胞質(zhì)變稀薄、濃縮;隨著時間的增加,菌絲逐漸斷裂,原生質(zhì)外流,直至病原菌絲解體。2.3落生長的抑制作用由表2可見,木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物對病原菌F12菌落生長有一定的抑制作用,其對棉花枯萎病F12菌絲生長的平均抑制率為35.89%;顯微鏡檢結(jié)果還表明,受抑制的F12菌絲變得通透,其細胞質(zhì)變得稀薄、濃縮。2.4棉織品對f2生長的抑制作用由表3可見,木霉GY20的培養(yǎng)過濾液,無論是過濾滅菌還是濕熱滅菌都可以抑制棉花枯萎病菌F12的生長,使其菌絲干質(zhì)量降低,抑制作用與濾液的體積分數(shù)成正比。不同滅菌方式下的滅菌液在相同稀釋倍數(shù)下,對F12菌絲干質(zhì)量作用間無顯著差異,說明木霉GY20的非揮發(fā)性代謝物具有熱穩(wěn)定性。2.5f2處理對棉花幼苗生長的影響溫室盆栽防治試驗結(jié)果(圖3)表明,與對照相比,棉花枯萎病菌F12處理后的棉花幼苗,生長受到很大的影響,近一半幼苗死亡或者整株萎蔫;而加入木霉GY20能有效防治(90%)棉花枯萎病。3討論1.2.4木霉菌在棉花枯渙病防治中的作用在每瓶含150mL的PD培養(yǎng)液的三角瓶中,接種同質(zhì)等量的GY20菌絲塊,在25℃恒溫搖床中震蕩培養(yǎng),7d后過濾發(fā)酵液。先用無菌脫脂棉濾去菌絲,離心(4000r/min,10min),取上清液,一部分采用0.22μm的細菌過濾器過濾除菌,另一部分采用濕熱滅菌,得到GY20的兩種發(fā)酵原液。兩種發(fā)酵原液分別用馬鈴薯浸提液稀釋成體積分數(shù)分別為0%、50%、100%。每瓶各接種同質(zhì)等量的1塊病原菌菌絲塊,每處理5個重復(fù)。25℃培養(yǎng)8d,濾取菌絲烘干稱量。3.1棉花枯萎病病靠土壤傳播,化學(xué)防治難度較大。本研究表明,俄羅斯綠色木霉菌株GY20對所測試棉花枯萎病菌F12有明顯的拮抗作用,說明該菌是一種較強的廣譜性拮抗真菌,因而在棉花枯萎病的生物防治中具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。3.2木霉菌對植物病原真菌的拮抗作用包括多種機制,包括競爭作用,產(chǎn)生抗生素及重寄生作用等。本研究表明,在平皿對峙培養(yǎng)中,木霉菌GY20可以抑制棉花枯萎病菌F12菌落的生長,表現(xiàn)為:(1)產(chǎn)生抑菌圈;(2)營養(yǎng)競爭作用,即覆蓋或深入棉花枯萎病菌F12的菌落中生長,占領(lǐng)大部分營養(yǎng)空間;(3)重寄生作用,即綠色木霉與病原菌接觸后能夠使菌絲的頂端及中間形成大量泡狀體、細胞壁變得通透和細胞質(zhì)變稀薄、濃縮,并且隨著培養(yǎng)時間的增加,菌絲逐漸斷裂,原生質(zhì)外流,直至病原菌被解體;(4)綠色木霉GY20能產(chǎn)生非揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì),兩者都能夠抑制棉花枯萎病的生長,但與非揮發(fā)生物質(zhì)相比,揮發(fā)性物質(zhì)的抑制作用相對較弱。3.3迄今為止,近60%的生物農(nóng)藥、生物肥料及生物土壤改良劑均以木霉屬進行開發(fā),傳統(tǒng)的木霉菌作用表現(xiàn)為,在植物生長發(fā)育過程中,木霉可以直接產(chǎn)生植物激素直接促進植物生長,能夠產(chǎn)生抗生素抑制病原菌的生長,使植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性,提高植物的抗病與防病的能力,從而間接發(fā)揮其防病作用。最近研究表明,木霉菌能