幾種PCR擴增的比較

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR的基本原理和操作環(huán)節(jié)普通PCR1概述聚合酶鏈式反映(PolymeraseChainReaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較含有實驗價值及實用性的KlenowfragmentofE.Coli則是于70年代的早期由Dr.H.Klenow所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性,因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反映?，F(xiàn)今所使用的酶(簡稱Taqpolymerase),則是于1976年從溫泉中的細菌（Thermusaquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一種很抱負的酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發(fā)表了第一種單純且短暫性基因復(fù)制（類似PCR前兩個周期反映）的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于1983由Dr.KaryB.Mullis發(fā)展出的，Dr.Mullis當年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年與Saiki等人正式發(fā)表了第一篇有關(guān)的論文。此后，PCR的運用一日千里，有關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量能夠說是令眾多其它研究辦法難望其項背。隨即PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎。2PCR原理PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反映環(huán)節(jié)構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，方便它與引物結(jié)合，為下輪反映作準備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）為反映原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保存復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保存復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保存復(fù)制鏈”，并且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完畢一種循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。3.PCR反映體系與反映條件3.1原則的PCR反映體系10×擴增緩沖液10μl4種dNTP混合物200μl引物10～100μl模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5μlMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水100μl3.2PCR反映五要素參加PCR反映的物質(zhì)重要有五種即引物(PCR引物為DNA片段，細胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。［PCR環(huán)節(jié)］原則的PCR過程分為三步：1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度減少，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)通過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些PCR由于擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完畢，因此能夠改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反映速度。4PCR反映特點4.1特異性強PCR反映的特異性決定因素為：底物與模板DNA特異對的的結(jié)合；②堿基配對原則；TaqDNA聚合酶合成反映的忠實性；基因的特異性與保守性。其中引物與模板的對的結(jié)合是核心。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵照堿基配對原則的。聚合酶合成反映的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反映中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)能夠在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的對的度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。4.2敏捷度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=10-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一種靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的敏捷度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌。4.3簡便、快速PCR反映用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反映液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反映，普通在2～4小時完畢擴增反映。擴增產(chǎn)物普通用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。4.4對標本的純度規(guī)定低不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。5PCR常見問題5.1假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反映的核心環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量，④PCR循環(huán)條件。尋找因素亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶克制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化解決，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化解決液，其程序亦應(yīng)固定不適宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析與否因酶的活性喪失或不夠而造成假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度與否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不抱負、容易彌散的常見因素。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一種好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要重視引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，并且兩引物帶的亮度應(yīng)大致一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，避免多次凍融或長久放冰箱冷藏部分，造成引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可減少PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反映體積的變化：普通進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應(yīng)用多大致積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大致積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理因素：變性對PCR擴增來說相稱重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而減少特異性擴增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而減少PCR擴增效率。有時尚有必要用原則的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。5.2假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整潔，亮度更高。引物設(shè)計不適宜：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種因素：一是整個基因組或大片段的交叉污染，造成假陽性。這種假陽性可用下列辦法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，避免將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，全部試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標本前，反映管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而造成假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR辦法來減輕或消除。5.3出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其因素：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。另首先是酶的質(zhì)和量，往往某些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。減少引物量，適宜增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適宜提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其因素往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引發(fā)。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適宜減少Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。原位PCR在科學(xué)研究中，每一項新技術(shù)的創(chuàng)立都會帶來一系列新的研究成果問世，從而推動著各學(xué)科的發(fā)展。縱觀形態(tài)研究領(lǐng)域，50年代電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀察領(lǐng)域，帶來了從細胞水平到亞細胞水平的進一步研究；60-70年代，免疫組織化學(xué)與免疫細胞化學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，又將觀察的水平由亞細胞構(gòu)造推向了蛋白質(zhì)分子水平，使細胞內(nèi)眾多的活性物質(zhì)得以進行細胞或亞細胞水平的定位，對醫(yī)學(xué)生物學(xué)的發(fā)展無疑產(chǎn)生了深刻的影響。70年代，分子生物學(xué)技術(shù)在形態(tài)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，隨著原位雜交技術(shù)的出現(xiàn)，使組織細胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列能夠被定位，將蛋白質(zhì)水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位，從而使人類對許多生命現(xiàn)象在基因水平上的認識得以深化；80年代，分子生物學(xué)領(lǐng)域中一項含有強大生命力的技術(shù)PCR——多聚酶鏈反映技術(shù)問世了，很快地就被引入形態(tài)學(xué)觀察的領(lǐng)域，使細胞內(nèi)低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進行定位及觀察。這一技術(shù)的問世，必將帶來更多的研究成果，使形態(tài)學(xué)的研究又向前邁出一大步。1基本原理原位PCR技術(shù)的基本原理，就是將PCR技術(shù)的高效擴增與原位雜交的細胞定位結(jié)合起來，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。PCR技術(shù)是在DNA聚合酶的作用下，通過模板的變性、退火和引物延伸三種循環(huán)，將引物引導(dǎo)下的特異性靶序列快速地進行擴增，通過擴增的靶序列（普通能擴增106倍），很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來，因此，PCR技術(shù)含有敏捷度高，特異性強的優(yōu)勢，隨著熱循環(huán)自動化的提高與穩(wěn)定也使得PCR技術(shù)的操作簡便易行。但是，PCR技術(shù)是在液相中進行的，在擴增前，需將細胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的成果與組織細胞的形態(tài)構(gòu)造聯(lián)系起來，同時，也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，保持了兩項技術(shù)的優(yōu)勢又彌補了各自的局限性。原位PCR技術(shù)的待檢標本普通先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細胞的良好形態(tài)構(gòu)造。細胞膜和核膜均含有一定的通透性，當進行PCR擴增時，多個成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內(nèi)或細胞核內(nèi)，以固定在細胞內(nèi)或細胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進行擴增。擴增的產(chǎn)物普通分子較大，或互相交錯，不易穿過細胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保存在原位。這樣原有的細胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴增，擴增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。2基本類型根據(jù)在擴增反映中所用的三磷酸核苷原料或引物與否標記，原位PCR技術(shù)可分為直接法和間接法兩大類，另外，尚有反轉(zhuǎn)錄原位PCR技術(shù)等。2.1直接法原位PCR技術(shù)直接法原位PCR技術(shù)是將擴增的產(chǎn)物直接攜帶標記分子，即使用標記的三磷酸腺苷或引物片斷。當標本進行PCR擴增時，標記的分子就摻入到擴增的產(chǎn)物中，顯示標記物，就能將特定的DNA或RNA在標本（原位）中顯現(xiàn)出來。慣用的標記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的辦法或用親和組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)的辦法去顯示標記物所在位置。直接法原位PCR技術(shù)的優(yōu)點是操作簡便，流程短，省時。缺點是特異性較差，易出現(xiàn)假陽性，擴增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點更為突出。由于在制片過程中，無論是固定，脫水還是包埋，都會造成DNA的損害，而受損的DNA可運用反映體系中的標記三磷酸核苷進行修復(fù)，這樣標記物就會摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽性。若用標記引物的辦法進行直接法原位PCR，其擴增的效率比不標記更低。2.2間接法原位PCR技術(shù)間接法原位PCR技術(shù)師現(xiàn)在細胞內(nèi)進行特定DNA或RNA擴增，再用標記的探針進行原位雜交，明顯提高了特異性，是現(xiàn)在應(yīng)用最為廣泛的原位PCR技術(shù)。間接法原位PCR與直接法不同的是，反映體系與常規(guī)PCR相似，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標記物。即實現(xiàn)先擴增的目的，然后用原位雜交技術(shù)去檢測細胞內(nèi)已擴增的特定的DNA產(chǎn)物，因此，事實上是將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來的一種新技術(shù)，故又稱之為PCR原位雜交(PCRinsituhybridization,PISH)。間接法PCR技術(shù)的優(yōu)點是特異性較高，擴增效率也較高。缺點是操作環(huán)節(jié)較直接法繁瑣。2.3原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)原位反轉(zhuǎn)錄PCR(insitureversetranscriptionPCR,InSituRT-PCR)是將液相的RT-PC技術(shù)應(yīng)用到組織細胞標本中的一種新技術(shù)，與RT-PCR（液相）不同點在于，進行原位反轉(zhuǎn)錄PCR反映之前，組織標本要先用DNA酶解決，以破壞組織中的DNA酶，這樣才干確保擴增的模板是從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的DNA。其它基本環(huán)節(jié)與液相的RT-PCR相似。3基本環(huán)節(jié)原位PCR技術(shù)的基本環(huán)節(jié)涉及標本的制備。原位擴增（PCR）及原位檢測等基本環(huán)節(jié)，現(xiàn)分述以下（重點以石蠟切片為例）。3.1標本的制備原位PCR技術(shù)可應(yīng)用于細胞懸液、細胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最佳，石蠟切片效果最差。隨著技術(shù)方面的某些問題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報道。效果不好的因素是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導(dǎo)較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為重要的因素，可能是標本經(jīng)制片后，細胞缺少完整的胞漿或核膜，擴增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而造成擴增的產(chǎn)物在原位不易保存。絕大多數(shù)的病理標本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能較好地解決石蠟切片原位PCR的有關(guān)技術(shù)問題，意義顯然是十分重大的。組織細胞的固定:普通認為組織細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進行原位PCR效果較好。固定的時間普通不適宜過長，視組織的大小，普通以4℃4-6小時為宜。切片的厚度:普通而言，切片若厚某些，原位PCR的效果也較好某些，由于切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同時膜構(gòu)造也較多，避免擴增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多，形態(tài)學(xué)觀察的效果就差了，分辨率也將下降。玻片的解決:為避免石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應(yīng)作防脫片解決，慣用的辦法是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化解決，普通能避免組織脫落。蛋白酶的消化作用:在進行原位擴增之前，組織標本需經(jīng)蛋白酶解決。經(jīng)蛋白酶消化的組織細胞，可增加其通透性，充足允許反映體系中的各成分進入細胞內(nèi)，并能較好的暴露靶序列，以利于擴增。慣用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據(jù)組織固定的程度進行調(diào)節(jié)。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過充足的洗滌將酶完全去除，由于只要有少量的殘留酶存在，都將對隨即進行的PCR反映體系的數(shù)量TaqDNA酶產(chǎn)生消亡性的影響。蛋白酶消化解決組織細胞可提高通透性，有助于后續(xù)進行的各反映成分進入細胞內(nèi)或核內(nèi)，但同時也使得擴增產(chǎn)物的彌散機會增多，有可能帶來假陽性或假陰性的成果。原位擴增（PCR）原位擴增即在組織細胞標本上進行PCR反映，其基本原理與液相PCR完全相似。引物:PCR所用的引物普通為15-30bp為宜，擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA極少超出400bp，RNA極少超出200bp，較長序列的擴增易引發(fā)引物與模板的錯配而造成非特異性反映的出現(xiàn)。反映體系:原位PCR的反映體系與常規(guī)的液相PCR基本相似，由于是在通過固定的組織切片上進行，為獲得較好的擴增效果，有人主張反映體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應(yīng)高于液相的PCR反映體系。在反映體系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以避免TaqDNA聚合酶與玻片的結(jié)合而減少了擴增效率。熱循環(huán):原位PCR的熱循環(huán)可在專門的熱循環(huán)儀上進行，操作簡便。也可在普通的PCR熱循環(huán)儀上進行，普通在樣品臺上覆蓋一層鋁箔，制成平臺，樣品臺上的空間用礦物油或水充填，將載玻片至于平臺上，即可進行熱循環(huán)的環(huán)節(jié)。為了確保進行充足的擴增，原位PCR熱循環(huán)中每一環(huán)節(jié)的時間可比常規(guī)PCR略長些，另外，也可采用熱啟動（hotstart）的辦法，即玻片加熱到80-94℃時，再立刻加入TaqDNA聚合酶。為了確保反映體系在熱循環(huán)過程但是多丟失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。洗滌:原位擴增結(jié)束后，標本應(yīng)清洗，以除去彌散到細胞外的擴增產(chǎn)物。洗滌不充足，會造成擴增產(chǎn)物在檢測時顯現(xiàn)，造成背景過深或假陽性成果的出現(xiàn)。但是，洗滌過分，也會造成細胞內(nèi)擴增的產(chǎn)物被洗脫，是陽性信號削弱或丟失。有作者在擴增后用4%多聚甲醛2小時或2%戊二醛5分鐘進行后固定，以使擴增的產(chǎn)物在檢測時能較好地保存在細胞內(nèi)，提高檢測的敏感性和特異性。原位檢測:原位PCR的擴增產(chǎn)物檢測辦法，取決于原位PCR的設(shè)計方案，直接法則根據(jù)標記分子的性質(zhì)對擴增產(chǎn)物直接進行原位檢測。間接法則需用原位雜交的辦法進行檢測。4原位PCR技術(shù)的應(yīng)用原位PCR技術(shù)的突出優(yōu)勢，就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數(shù)較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質(zhì)，可將原位PCR的應(yīng)用分為檢測外源性基因和內(nèi)源性基因兩方面。4.1用于外源性基因的檢測4.1.1病毒基因的檢測感染病毒的細胞常無較好的檢測手段，但當原位PCR技術(shù)應(yīng)用后，使這一極為困難的問題有望解決。對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多個病毒的檢測，使我們能夠成功等觀察到這些病毒在艾滋病、生殖系統(tǒng)腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠及時發(fā)現(xiàn)受感染的人群。4.1.2細菌基因的檢測最突出的應(yīng)用是在結(jié)核桿菌的檢測上，當結(jié)核病變不夠典型時，通過特殊染色的辦法很難在鏡下找到結(jié)核桿菌，而應(yīng)用原位PCR技術(shù)可協(xié)助明確診療，當結(jié)核桿菌極少時仍能在鏡下被很容易地找出來。4.1.3導(dǎo)入基因的檢測在轉(zhuǎn)基因動物的研究中，與否導(dǎo)入了基因，在接受基因治療的患者體內(nèi)，與否接受了導(dǎo)入的基因，均可用原位PCR技術(shù)來證明。因此，原位PCR技術(shù)成為重要的檢測手段。4.2用于內(nèi)源性基因的檢測4.2.1異?；虻臋z測機體內(nèi)基因的突變、重排、也可用原位PCR技術(shù)進行檢測，原癌基因，抑癌基因的突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排，對腫瘤的研究和診療無一均提供了廣闊的應(yīng)用前景。4.2.2固有基因的檢測對于機體細胞內(nèi)只有單個或幾個拷貝的低體現(xiàn)固有基因，原位雜交技術(shù)因基因拷貝數(shù)太少而無能為力，液相PCR雖可進行擴增檢測出來，但不能擬定含有該基因的細胞類型，原位PCR技術(shù)則彌補了上述兩種技術(shù)的局限性，使得我們能夠?qū)θ祟惗鄠€基因進行檢測，而完畢人類基因圖的繪制。反向PCR反向PCR(reversePCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究.反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反映體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物即使與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3’端是互相反向的。擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一種環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的擬定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴增。反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反映體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物即使與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3’端是互相反向的。擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一種環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的擬定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。該辦法的局限性是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種適宜的酶進行酶切才干得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功效序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。運用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。合用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點分析等研究。用傳統(tǒng)的緩沖液和其它提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由PCR擴增片段的大小決定，現(xiàn)在，PCR擴增的事實上限為3-4kb。在許多狀況下，首先需要進行Southern雜交來擬定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列，初試時最佳靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點。如果用反向PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入適宜的酶切位點。用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在某些實驗中，為產(chǎn)生對反向PCR大小適宜的DNA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán)化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切酶失活。聚合酶鏈反映條件與典型所用的相似，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火，Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環(huán)?？勺兓疨CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向PCR用于測序時，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。描述一種大聚合酶鏈反映應(yīng)用的辦法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知成幾何級數(shù)擴增用適宜的限制性內(nèi)切裂解含核心區(qū)的，以產(chǎn)生適合于擴增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其方向性，使鏈的延長通過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)這種反向辦法可用于擴增原來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列探針或測定邊側(cè)區(qū)域本身的上下游序列。逆轉(zhuǎn)錄PCR1概念RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄RCR（reversetranscriptionPCR）和實時PCR（realtimePCR）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈式反映(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完畢。隨即，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完畢，隨每個循環(huán)倍增，即普通的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補DNA。RT-PCR的指數(shù)擴增是一種很敏捷的技術(shù)，能夠檢測很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診療，并且能夠用