植物dna去甲基化酶基因的克隆與功能分析

植物dna去甲基化酶基因的克隆與功能分析

二甲基硝基化是一種重要的表觀遺傳特征，包括組織機械的壓碎、重組印花、x染色體的失去等生物學(xué)過程。DNA甲基化能夠調(diào)節(jié)植物的早期發(fā)育、基因座專一性基因表達。在高等植物中,有CG、CHG和CHH(H代表A、C或T)3種甲基化位點,其中CG和CHG位點的甲基化是直接調(diào)節(jié)基因表達最主要的甲基化形式。DNA的甲基化水平和模式取決于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶。植物中的甲基轉(zhuǎn)移酶主要有甲基轉(zhuǎn)移酶1(MET1)、結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶(DRM)和染色質(zhì)甲基化酶(CMT)3類,對應(yīng)動物中的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。MET1能維持重復(fù)和單拷貝DNA序列中CG類型的甲基化,并影響形態(tài)特征、花期調(diào)控和移植變化;DRM包括DRM1、DRM2和Zmet3,對非對稱位點的DNA序列進行從頭甲基化,維持失活轉(zhuǎn)座子及轉(zhuǎn)基因沉默位點的胞嘧啶甲基化,同時也能對與siRNA同源的序列中的胞嘧啶進行從頭甲基化;CMT主要維持CHG和CHH核苷酸序列中胞嘧啶的甲基化,同時也能對與siRNA同源的序列的胞嘧啶進行從頭甲基化;此外,還有通過MET1維持CG甲基化的HDA6、通過CMT3維持非CG甲基化的SUV家族、從頭進行DNA甲基化的NRPD1b等其他甲基化酶。研究表明,MET1、DRM和CMT基因突變后可以引起擬南芥(Arabidopsisthaliana)整個基因組或部分基因DNA甲基化水平發(fā)生改變[15~17]。DNA去甲基化酶基因中含有最保守的DNA糖苷酶結(jié)構(gòu)域。在植物中,DNA糖苷酶結(jié)構(gòu)域是一種雙功能團:一方面直接剪切甲基胞苷,另一方面能在脫堿基位點裂開DNA主鏈;然后通過DNA堿基的切除修復(fù)途徑(DNA聚合酶和連接酶)用無修飾的胞苷填補堿基空位。DNA糖苷酶有兩種:一種只是水解堿基和脫氧核糖之間的糖苷鍵,另一種不僅水解堿基和脫氧核糖之間的糖苷鍵,并且具有脫嘌呤嘧啶內(nèi)切核酸酶的作用,裂解DNA主鏈的無堿基位點。DNA去甲基化酶基因主要有4個家族:DME、ROS1、DML2和DML3。只存在于雙子葉植物中的DME,通常在雌配子體的中央細胞和助細胞中優(yōu)先表達,從而影響胚和胚乳的發(fā)育,而ROS1在植物的所有組織中都有表達,它能抑制基因啟動子的甲基化。如水稻(Oryzasativa)中的ROS1b(DNG701)基因的表達能夠調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tos17的甲基化水平,進而改變其轉(zhuǎn)座活性。DML2和DML3主要是抑制植物營養(yǎng)組織中特定位點的DNA甲基化。對DNA糖苷酶的結(jié)構(gòu)域序列進行分析顯示,ROS1是雙功能團的DNA糖苷裂解酶,而DME為單功能團糖苷酶,但有研究也表明DME、DML2、DML3和ROS1一樣是雙功能團的DNA糖苷裂解酶[26~28]。在植物生長發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答過程中,DNA去甲基化能夠激活一些特殊基因的功能以及對基因組后生狀態(tài)進行重置,分為被動去甲基化和主動去甲基化。在DNA復(fù)制時,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的失活會導(dǎo)致DNA被動去甲基化;而與DNA復(fù)制無關(guān)的DNA主動去甲基化則需要DNA去甲基化酶參與,并且在DNA主動去甲基化中占主導(dǎo)地位。DNA主動去甲基化可以阻止內(nèi)外源基因的轉(zhuǎn)錄沉默,調(diào)節(jié)印跡基因和轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄。ROS1介導(dǎo)的DNA主動去甲基化可引起5SrDNA染色質(zhì)的解凝,以及引起植物對生物脅迫和環(huán)境脅迫的響應(yīng)[34~36];另外,還可以阻止RNA介導(dǎo)的DNA甲基化。DRM2通過siRNA的裝載可以對整個序列上的胞嘧啶(CG、CHG和CHH)進行甲基化,從而促使含有同源DNA序列的基因轉(zhuǎn)錄沉默[37~40]。已有的研究表明,當(dāng)基因的啟動子能夠生成24nt的siRNA時,該基因就能被RNA介導(dǎo)的DNA甲基化所沉默。DNA去甲基化酶在DNA主動去甲基化中起到重要作用。迄今為止,植物DNA去甲基化酶基因的功能研究主要集中在水稻和擬南芥中,然而對于其在不同物種中的進化與線性同源關(guān)系還不太清楚,這在一定程度上限制了對該基因家族的有效利用。本文選取已知的10個DNA去甲基化酶基因為參照,通過序列比對從水稻、高粱(Sorghumbicolor)、擬南芥、毛果楊(Populustrichocarpa)基因組中分別獲得8、6、7、6個同源基因,絕大部分基因在染色體上的位置是線性同源的;同時基于糖苷酶保守區(qū)域的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,探究DNA去甲基化酶基因在高等植物中的進化關(guān)系;水稻和擬南芥中的基因表達分析表明,基因的組織特異性表達與進化密切相關(guān)。該研究有助于進一步研究DNA的主動去甲基化以及DNA去甲基化酶基因表觀調(diào)控的有效利用。1材料和方法1.1dna去甲基化酶基因雙子葉植物擬南芥中有4個DNA去甲基化酶基因:ROS1、DME、DML2和DML3;而單子葉植物水稻中有6個DNA去甲基化酶基因:ROS1a、ROS1b、ROS1c、ROS1d、DML3a和DML3b。以水稻、擬南芥中的這10條基因的氨基酸序列為參考,以E<e-51.2糖苷酶保守區(qū)域氨基酸序列的獲取以DNA去甲基化酶基因中最保守的糖苷酶結(jié)構(gòu)域為對象,利用WebLogo3軟件(/create.cgi)獲得糖苷酶保守區(qū)域氨基酸序列的Logo圖。同時使用ClustalX軟件進行多序列聯(lián)配,并用MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,構(gòu)建方法選用最大似然法,采用最佳的WAG模型,Bootstrap值設(shè)為1000。1.3全民主義基因同源片段的獲得以所有鑒定出的DNA去甲基化酶基因為參照,分別選取其上、下游的基因,在水稻、高粱、擬南芥、毛果楊基因組中尋找同源基因,獲得對應(yīng)的染色體同源區(qū)段。1.4水稻和擬南甲基化酶的發(fā)現(xiàn),用微陣列分析工具MeV軟件(MultiExperimentViewer)得到基因表達的熱圖(heat-map)。2結(jié)果與分析2.1dna去甲基化酶基因本研究以擬南芥和水稻中已知的10個DNA去甲基化酶基因的氨基酸序列為參照,在水稻、高粱、擬南芥和毛果楊中分別找到8、6、7、6個DNA去甲基化酶同源基因(表1)。在水稻中新鑒定出2個基因Os06g13070和Os11g16580;在擬南芥中新鑒定出3個基因AT1G05900、AT2G31450和AT3G47830。DNA去甲基化酶基因的數(shù)目在4個物種中相差不大(僅0~2個),表明控制植物DNA主動去甲基化的基因數(shù)目相仿。然而DNA去甲基化酶基因的氨基酸殘基長度卻有顯著差異,短序列變幅在277~386個氨基酸,長序列為901~1987氨基酸。在水稻、高粱、擬南芥和毛果楊4個物種中DNA去甲基化酶基因以長序列居多,但其短和長的比例并不相同,分別為3:5、1:5、2:5和2:4。DNA去甲基化酶基因多數(shù)分布在不同的染色體上,具有隨機性。如擬南芥中的5對染色體上均有DNA去甲基化酶分布,水稻中DNA去甲基化酶多數(shù)位于較長染色體(1、2、4、5、6)上,高粱中則多數(shù)分布于較短染色體(6、8、9、10)上,而毛果楊中多分布在19對染色體的中等長度染色體(6、7、8、10)上。DNA去甲基化酶基因在染色體上的分布見表1。2.2高等植物中dna去甲基化酶基因的進化氨基酸序列是酶的一級結(jié)構(gòu),相對于堿基序列更能反映不同DNA去甲基化酶基因間的關(guān)系。鑒于DNA去甲基化酶基因全長序列在不同物種或同一物種不同家族中差異較大,不適合做進化分析。因此,本研究選擇其最保守的糖苷酶結(jié)構(gòu)域149個氨基酸加以分析(圖1)。結(jié)果表明,該結(jié)構(gòu)域由8個螺旋區(qū)(1-9、15-20、28-33、39-50、59-68、84-95、119-130、138-149)組成,而且發(fā)現(xiàn)有6個氨基酸非常保守,它們是賴氨酸(K,40位)、天冬氨酸(D,59位)和半胱氨酸(C,133位、140位、143位、149位)(圖1)。為揭示高等植物中DNA去甲基化酶基因的進化關(guān)系,本研究采用最大似然法構(gòu)建DNA去甲基化酶基因的分子系統(tǒng)進化樹。所有的基因分為4個亞家族:ROS1,DML3,DML4和DML5,其中ROS1和DML3亞家族中含有已知的10個基因,而DML4和DML5亞家族中是新鑒定的基因(圖2A)。本文發(fā)現(xiàn)在ROS1亞家族中,單子葉植物的ROS1基因都聚集在一起,而雙子葉植物的ROS1則和DME基因聚集在一起。對該組基因全長氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)雙子葉植物中的DME與ROS1基因的同源性高于與單子葉植物ROS1基因的同源性(圖2B),推測雙子葉植物的DME基因是從ROS1基因復(fù)制過來的,并且與單子葉植物的ROS1基因?qū)偻椿?。在單、雙子葉植物分化之后,單子葉植物內(nèi)部ROS1基因還繼續(xù)復(fù)制產(chǎn)生新的ROS1基因,甚至水稻和高粱從共同祖先分化之后,水稻中的ROS1基因仍在復(fù)制(ROS1a和ROS1b)。在DML3亞家族中所有的DML3基因聚在一起,通過全長序列分析進一步證實了該結(jié)果(圖3C),但擬南芥的DML2與ROS1同源性高于與DML3基因之間的同源性,推測DML2與ROS可能是同源基因。而在新鑒定的DML4和DML5亞家族中4個物種都有相應(yīng)的同源基因(圖3A),表明此兩類亞家族基因很保守,為此,根據(jù)序列的同源性分別將其命名為DML4和DML5(表1)。2.3醇溶蛋白基因與dna的同源關(guān)系為了驗證在系統(tǒng)進化分析中結(jié)果的可靠性,本研究對所有的DNA去甲基化酶基因在基因組位置上的共線性進行分析。水稻中的Os05g37350(ROS1b和Os05g37410(ROS1c)是串聯(lián)復(fù)制基因,這兩個基因和高粱的Sb09g021920(ROS1b)是線性同源基因;水稻Os02g29230(ROS1d)與高粱的Sb04g019820(ROS1d)是同源基因;然而在高粱中卻找不到Os01g11900(ROS1a)的線性同源基因,推測該基因可能被缺失或者在水稻中獲得新復(fù)制的Os01g11900(ROS1a)基因;同時高粱中多了Sb08g008620(ROS1e),從系統(tǒng)進化分析結(jié)果可以推斷該基因可能是從Sb04g019820(ROS1d)基因復(fù)制得到的(圖2,圖3A)。本研究發(fā)現(xiàn),在雙子葉植物中,擬南芥的DME基因(At5G04560)與毛果楊的DME基因(DMEa,Potri.008G025900和DMEb,Potri.010G234400)是線性同源基因(圖3A);而擬南芥的At3G10010(DML2)基因與At2G36490(ROS1)和Potri.006G116000(ROS1)線性同源(圖3A),暗示毛果楊的DMEa和DMEb以及擬南芥的DML2與ROS1是由染色體復(fù)制或者是全基因組復(fù)制所產(chǎn)生的,隨后經(jīng)過長期復(fù)雜的進化,At3G1001(DML2)和At2G36490(ROS1)在結(jié)構(gòu)和功能上會發(fā)生變化。進一步分析發(fā)現(xiàn)DME與ROS1以及DML2位點之間存在同源關(guān)系,表明擬南芥和毛果楊分化之前發(fā)生過一次全基因組復(fù)制,這與之前的研究結(jié)果相一致。在DML3亞家族中5個DML3同源基因Os02g29380(DML3a)、Os04g28860(DML3b)、AT4G34060(DML3)、Potri.001G150000(DML3)和Sb06g029335(DML3)之間不存在線性同源關(guān)系(圖3B),推測這是因為DNA去甲基化酶DML3基因家族在進化過程中經(jīng)歷多次基因復(fù)制和丟失事件,在葉綠體基因組進化過程中發(fā)生過類似情況。在禾本科醇溶蛋白基因家族進化過程中,不同亞科物種間的醇溶蛋白基因不存在線性同源關(guān)系,是獨立進行遺傳。DNA去甲基化酶基因DML3亞家族不但在單、雙子葉植物物種間存在獨立遺傳,而且在單子葉植物內(nèi)部不同亞科間也是獨立遺傳。但是,在DML4和DML5亞家族中新鑒定的DNA去甲基化酶基因卻有著非常保守的線性同源關(guān)系(圖3:C,D)。2.4dna去甲基化酶基因表達為進一步理解DNA去甲基化酶基因的表達模式和水平,本研究對水稻的RNA高通量測序結(jié)果和擬南芥的芯片結(jié)果進行了分析。在水稻的不同發(fā)育階段,11種組織中DNA去甲基化酶基因的表達量差異明顯,Os02g29380(DML3a)、Os11g16580(DML5)和Os01g11900(Ros1a)的表達量都較高,而Os01g28860(DML3b)、Os02g29230(Ros1d)都較低(圖4A)。大多數(shù)DNA去甲基化酶基因在雌蕊、花序和胚中的表達要明顯高于其他組織,只有2個基因DML3b和Ros1d的表達量較低。可見DNA去甲基化酶基因的表達具有組織特異性。另外,與其他組織相比,DNA去甲基化酶基因在水稻胚乳中的表達量較低,這與胚乳的DNA甲基化水平低于其他組織相吻合,推測胚乳中的DNA去甲基化酶基因主要參與DNA的被動去甲基化。DNA去甲基化酶基因還具有時空表達的特異性。在擬南芥12個不同組織中的表達顯示,多數(shù)基因的表達量在營養(yǎng)生長期隨著播種天數(shù)增加而升高(圖4B),進入生殖生長期后,在雄蕊和衰老葉片中表達量下降(圖4:C,D)。然而,At5G04560(DME)和At1G05900(DML5b)在所有組織中的表達均相對較低。3dna去甲基化酶基因DNA去甲基化酶基因普遍存在于植物基因組中,本研究結(jié)果顯示在單子葉、雙子葉植物分化之前至少存在4個DNA去甲基化酶(類似)基因(Ros1、DML3、DML4和DML5),其中新鑒定的2個基因(DML4和DML5)在單、雙子葉植物中非常保守(圖2A,圖3:C,D),表達量也較高(圖4:A,B),表明它們具有重要的潛在功能,有待進一步實驗驗證。在物種的進化過程中,DNA去甲基化酶基因家族存在著串聯(lián)復(fù)制、局部復(fù)制和全基因組復(fù)制等3種復(fù)制形式(圖3)。同時在ROS和DML3組中發(fā)生過基因丟失,特別是DML3,然而與禾本科中的醇溶蛋白基因家族類似,在該基因丟失之前復(fù)制了同源基因(圖3B)。擬南芥ROS家族中的Ros1、DML2和DME基因是全基因組復(fù)制所產(chǎn)生的同源基因,然而由于基因突變使得3個基因的功能都發(fā)生了變化,這是由于物種進化過程中產(chǎn)生基因無功能化、新功能化和亞功能化所致,也說明DNA去甲基化酶基因在進化過程中會更加傾向趨異進化。不同的DNA甲基化酶基因通常會有不同的甲基化模式,DRM2調(diào)節(jié)CHH位點的甲基化,MET1調(diào)節(jié)CG位點的甲基化,CMT3調(diào)節(jié)CHG位點的甲基化,然而DNA去甲基化酶基因卻沒有這種作用模式,一些ROS1偏好CHG位點,而另一些對胸腺嘧啶前的CG也有偏好性。DME基因從DNA上移除甲基胞苷,然后通過一個相關(guān)蛋白去甲基化,是基因組印記所必需的;Ros1通過去除基因啟動子區(qū)域的甲基化阻遏輸入基因和同源基因的