生防木霉對黃瓜枯萎病的田間防治效果

生防木霉對黃瓜枯萎病的田間防治效果

1932年，威赫發(fā)現(xiàn)木霉對植物致病性菌的抗劑效果。在過去的70年里，國內外專家對木霉生物藥的開發(fā)利用和抗劑機制進行了深入的研究和大膽的嘗試。但選擇木霉進行田間防治時,土壤中的環(huán)境因素如水勢、pH、殺菌劑、金屬離子及微生態(tài)系統(tǒng)等對其作用的發(fā)揮產生了極大的影響,使木霉藥劑在實際應用中存在著防病效果不明顯、不穩(wěn)定等弊端。因此,對生防木霉的開發(fā)研究中,生防因子本身在土壤中的定殖能力,是衡量其對病害的控制程度及應用前景的重要因素。木霉能夠分泌幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶等多種細胞壁水解酶,進而分解某些病原菌的細胞壁,寄生于病原菌中或抑制病原孢子的萌發(fā)。該研究以纖維素豐富的菌糠為原料,發(fā)酵生防木霉,研究該木霉發(fā)酵物對黃瓜枯萎病的防治效果和菌糠對木霉在根際定殖能力的影響,并通過對土壤中由木霉產生的2種細胞壁降解酶幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性測定,探討2種酶的含量同木霉的根際定殖能力和對病原菌防治效果間的關系,為木霉生防作用的研究提供思路。1材料和方法1.1供試菌株及儀器食用菌菌糠采自北京大興食用菌栽培地,主要是栽培平菇的棉籽殼。供試菌株:黃瓜尖孢鐮刀菌(Fusariumoxyporum)KW,綠色木霉(Trichodermaviride)TH4,由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所菜病綜防組提供。1.2測試方法1.2.1生長曲線及種子處理病原菌菌懸液的制備:挑取在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)3d的KW菌塊,轉接到PD培養(yǎng)基中,在25℃120r/min的搖床上震蕩培養(yǎng)7d,配成濃度為1×106個/mL的KW菌懸液。拮抗木霉菌的制備:綠色木霉TH4在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5d后,刷下孢子配成濃度為4×106個/mL孢子懸浮液,接種在菌糠上。在25℃pH5.5左右條件下,綠色木霉TH4在菌糠上發(fā)酵6d,孢子濃度為6.2×109個/g菌糠;PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5d的,大量綠色木霉TH4孢子刷下配成濃度為4×1011個/mL孢子懸浮液;PD培養(yǎng)基中25℃120r/min的搖床上震蕩培養(yǎng)5d,培養(yǎng)液雙層紗布過濾,除去菌絲,加適當水稀釋成濃度為1×1011個/mL的孢子懸液。種子處理:將黃瓜種子經0.1%升汞水浸種10min,清水沖洗,然后浸泡12h左右,放在28℃的恒溫箱內催芽,當胚根長至1.0cm左右時開始種苗。試驗設計:栽培土處理:①菌糠綠色木霉TH4發(fā)酵物與栽培土1∶20比例混和作為栽培基質,每1000g的栽培基質中含有108個/g孢子,分裝于35個栽培缽中;②1000g栽培土與綠色木霉TH4PD培養(yǎng)基發(fā)酵物混合作為栽培基質,含108個/g木霉孢子,分裝于35個栽培缽中;③1000g栽培土與綠色木霉TH4菌懸液作為栽培基質,含108個/g木霉孢子,分裝于35個栽培缽中;④栽培土作栽培基質向其中加入70%甲基托布津藥劑,分裝于35個缽中;⑤栽培土與菌糠(未發(fā)酵)1∶20混合,分裝于35個缽中。將黃瓜種子播種于裝好土的栽培缽中,然后在栽培缽中注入事先配好的KW菌懸液。每個處理5次重復,每次重復7株苗。1.2.2黃瓜苗根栽培土的制備在黃瓜苗生長的第0、3、6、9、12、15、20、30天,采集黃瓜苗根部5g栽培土,溶于10mL磷酸鈉緩沖液(pH6.4)中。將懸浮液于4℃10000r/min下,離心20min吸取上清液,測試土壤中幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活性。1.3項目測量1.3.1病情調查分級3～5d出芽后,每天調查發(fā)病情況、病害程度,計算發(fā)病率和病情指數(shù)。黃瓜枯萎病的分級標準:0級:無癥狀;1級:莖,葉輕微癥狀;2級:植株輕度萎蔫,莖出現(xiàn)壞死斑,葉片黃化;3級:植株中度萎蔫,葉片下垂黃化;4級:植株嚴重萎蔫,倒狀枯死。病情指數(shù)=∑(各級病葉數(shù)×相應級別)/(調查總葉數(shù)×最大級數(shù))×100%;防治效果(%)=(空白對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/空白對照病情指數(shù)×100%。1.3.2菌落計數(shù)測定在第7、10、15天,采集各處理土樣1g,加入10mL滅菌水,進行梯度稀釋,分別稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍;吸取100μL10-3、10-4、10-5稀釋液均勻涂布在木霉選擇性培養(yǎng)基上,置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d觀察菌落數(shù),進行計數(shù);若平板上木霉菌落數(shù)多于20個,再取10-6、10-7倍稀釋液繼續(xù)涂布培養(yǎng)觀察,每處理3次重復。1.3.3底物和酶的制備取0.4mL0.05mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.0),加入0.5mL濃度2mg/mL的昆布多糖溶液(用前用沸水煮2min),再加入0.1mL的酶液,然后在50℃水浴1h。加入3mL3,5-二硝基水楊酸試劑中止反應,之后于100℃水浴5min,冷卻至25℃后在660nm測吸光度值,空白對照不加底物多加0.1mL醋酸鈉緩沖液。以同樣處理包括底物和酶(100℃加熱失活)反應液為標準對照。對照標準曲線求出樣品液中的還原糖量,確定酶活。1.3.4脫鹽蝸酶活性測定吸取1000μL膠狀幾丁質溶液(10mg/mL)加入800μL磷酸鈉緩沖液(10mmol/L,pH6.4)和200μL的樣品液混和,37℃保溫2h,隨后于100℃水浴煮3min,10000r/min離心10min,取上清液100μL加20μL0.1mol/LpH7.1的磷酸鈉緩沖液和80μL3%脫鹽蝸牛酶水溶液,37℃保溫30min,繼續(xù)加入100μL0.1mol/LpH9.2的四硼酸鉀溶液,100℃水浴精確煮沸3min,冷卻后加入3mLDMAB溶液混勻,37℃保溫20min,冷卻后立即在585nm波長讀取吸光度值?？瞻讓φ詹患拥孜锒嗉?.1mL磷酸鈉緩沖液(10mmol/LpH6.4)。以同樣處理包括底物和酶(100℃加熱失活)反應液為標準對照。對照幾丁質酶2條標準曲線,求出N-乙酰葡萄糖的量,最終確定酶活。1.4數(shù)據(jù)分析將調查的菌落數(shù)以SAS9.0進行數(shù)據(jù)相關性分析。2結果與分析2.1綠色木霉th4不同的種植方法對防止黃瓜枯萎2.1.1有關綠色木霉th4接種方式的討論由圖1可知,綠色木霉TH4菌糠發(fā)酵物對黃瓜根部枯萎病的防治效果為64.23%,明顯高于木霉其它接種方式,這可能由于菌糠媒介促進了綠色木霉TH4在根部的定殖。而只向其中加入木霉菌懸液后,木霉菌的生長受到限制,不能大量定殖繁殖,所以限制了其對枯萎病的防治效果。2.1.2不同土壤肥力對菌糠木霉生長的影響由表1可知,在純栽培土中木霉的數(shù)量很少,甲基托布津化學藥劑的加入對病原菌抑制的同時也對綠色木霉TH4生長有抑制作用。向栽培土中加入木霉的時候,木霉在土壤中的定殖能力與土壤的營養(yǎng)成分密切相關,菌糠的加入為木霉提供了豐富的碳氮源,大大提高了綠色木霉TH4在植株根部的定殖能力,這直接決定了菌糠木霉發(fā)酵物對根部病害防治效果。而直接向栽培土中引入木霉由于栽培土營養(yǎng)缺乏使木霉生長處于弱勢狀態(tài),影響了它對根部枯萎病的防治效果。因此,推測營養(yǎng)競爭在木霉對于黃瓜枯萎病根部病害的防治過程中可能起到重要的作用。2.2幾丁質酶的增加由圖2、3可知,添加1∶20菌糠綠色木霉TH4發(fā)酵物的栽培土中,栽培接種被鐮刀菌侵染的黃瓜種子,栽培土中的木霉在鐮刀菌誘導作用下會分泌一些可以破壞病原菌細胞壁的水解酶β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶。含1/20菌糠綠色木霉TH4發(fā)酵物的栽培土中2種水解酶的含量明顯高于只含有純栽培土的培養(yǎng)基質。而且,同接種相同孢子濃度的木霉菌懸液的栽培基質相比,存在絕對的優(yōu)勢。這可能是由于菌糠栽培基質的加入促進了木霉在土壤中的定殖,使土壤中富集了大量的木霉孢子,在病原菌誘導作用下,木霉菌產生大量β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶,來抑制病原菌的擴繁,進而黃瓜對根部病原菌的侵染產生防御作用。含有木霉的栽培土中,在黃瓜幼苗生長的3～9d內,木霉菌分泌出大量的β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶,隨著生長周期變長,木霉分泌的水解酶含量逐漸減少,但始終遠高于對照中2種水解酶的含量。3菌糠和土壤酶活性研究生防木霉在防治蔬菜土傳病害時,往往受到溫度、濕度、酸堿度等多種環(huán)境因素的干擾,而嚴重影響了其在蔬菜根部的定殖,降低了對病害的防治效果。該研究將菌糠作為一種生防木霉生長的載體,將其添加到栽培土中,一方面改善了植株根部的營養(yǎng)條件及生長環(huán)境,另一方面菌糠中豐富的纖維素資源促進了木霉在黃瓜根部的定殖,進而達到提高生防木霉對根部病害的防治效果。從綠色木霉TH4不同接種方式對病害防治效果中可以看出,綠色木霉TH4菌糠發(fā)酵物的加入促進了木霉在栽培土中的生長繁殖,使黃瓜根部富集大量生防因子,從而抑制病原菌對黃瓜根部的侵染。另外,菌糠的引入向根際微生態(tài)中增加了的碳氮成分,改變了根際微生物的主成,誘導黃瓜產生系統(tǒng)性抗性抵制病原菌的侵染。將菌糠木霉發(fā)酵物加入土壤中,栽培接種了尖孢鐮刀菌侵染的黃瓜種子,定時采集土樣檢測栽培土中幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性。通過試驗對比可知,菌糠木霉發(fā)酵物的加入促進了木霉在土壤中的定殖,在木霉含量增多的同時促進了栽培基質中幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的增多,同直接加入木霉菌懸液的栽培土相比酶的活性提高了5～6倍。該研究對木霉的生防效果衡量時,首次檢測了土壤中幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性,從試驗結果可以看出,2種細胞壁分解酶的含量同栽培基質對尖孢鐮刀菌防治效果及土壤中木霉定殖數(shù)量呈正相關。隨著人們生