高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血液中8種有毒生物堿

高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血液中8種有毒生物堿

1體外毒性成分檢測(cè)天然結(jié)構(gòu)是中醫(yī)學(xué)的重要療效成分。同時(shí)，還報(bào)告了由于不適當(dāng)?shù)闹委?、臨床劑量不足、誤用、故意中毒等引起的有毒代謝物中毒的例子。因此,建立快速、靈敏、可靠的中毒樣品中痕量生物堿的分析檢測(cè)方法具有重要意義。含有毒生物堿的植物分布極其廣泛,在各科各屬中均有分布,如毛莨科的草烏、附子等含有烏頭堿;馬錢科的馬錢子含馬錢子堿、士的寧,鉤吻含鉤吻素子;茄科的洋金花,曼陀羅等含阿托品。這些生物堿的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、類型多樣,毒性大,中毒劑量很低(如:烏頭堿小鼠經(jīng)口LD50為1.8mg/kg,對(duì)人的中毒劑量(口服)為0.12mg,致死量為3～5mg),在中毒病人體液中含量極低,中毒無(wú)特異性臨床表現(xiàn),這些特性使得有毒生物堿的分析鑒定成為一個(gè)難題。目前,對(duì)于體液中有毒生物堿的檢測(cè)常用的方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[6,7,8,9,10,11,12,13,14]。HPLC檢出限通常在100μg/L以上,很多情況下不能滿足毒物鑒定的需要,且僅以保留時(shí)間進(jìn)行定性分析存在不足,目標(biāo)物濃度低時(shí)基質(zhì)干擾嚴(yán)重、選擇性差,易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;GC-MS適用于揮發(fā)性成分的分析,而生物堿大多為高沸點(diǎn)化合物,需要衍生化后才能進(jìn)行分析,操作繁瑣。LC-MS具有液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度,并且可以得到化合物的相對(duì)分子質(zhì)量、特征結(jié)構(gòu)碎片等信息,其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)可進(jìn)一步提高靈敏度與選擇性,在中毒樣品的痕量分析方面具有很大的優(yōu)勢(shì),利用LC-MS技術(shù)檢測(cè)生物樣品中有毒生物堿的分析的大部分研究?jī)H限于對(duì)某一種或來(lái)源相同的某幾種生物堿的檢測(cè),對(duì)來(lái)源不同的多種有毒生物堿檢測(cè)的研究很少,并且存在覆蓋范圍不廣,以及提取回收率低的不足。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)對(duì)人血中多種來(lái)源不同有毒生物堿的LC-MS/MS檢測(cè)方法,并對(duì)方法的回收率、穩(wěn)定性、重復(fù)性等進(jìn)行了驗(yàn)證。此法可大大提高檢測(cè)效率,避免漏檢,已在實(shí)際檢測(cè)工作中應(yīng)用。2實(shí)驗(yàn)部分2.1酶體系1200RRLC高分離度快速液相色譜儀、6410BTripleQuad三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。XK96-A快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);AS3120超聲波發(fā)生器(AutoScience公司);TDL-40B離心機(jī)(Anke公司);HGC-12氮吹儀(上海歡奧科貿(mào)有限公司)。馬錢子堿、士的寧、喜樹堿、硫酸阿托品和硝酸毛果蕓香堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所),烏頭堿、鉤吻素子和鹽酸麻黃堿(天津一方科技有限公司),純度均>95%,用分析純甲醇配制成100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,儲(chǔ)存于4℃冰箱中。甲醇(色譜純,SKChemical公司),甲醇、氨水和乙酸銨(分析純,廣州化學(xué)試劑廠),二次蒸餾水(自制)。2.2流動(dòng)相v的提取取血液0.5mL于10mL離心管中,加入1mL乙酸銨-氨水緩沖溶液(pH≈9),充分混勻,加入2mL甲醇,渦流混合2min,超聲10min,4500r/min離心10min,取上清液,重復(fù)提取一次,合并上清液,45℃下用氮?dú)獯蹈?加入1.0mL起始梯度流動(dòng)相V(甲醇)∶V(100mmol/L乙酸銨)=∶1溶解,過(guò)0.22μm微孔濾膜,待分析。2.3柱溫度和進(jìn)樣量的確定AgilentZorbaxEclipsePlusC18色譜柱(50mm×2.1mm,1.8μm);流動(dòng)相:10mmol/L乙酸銨水溶液(A)+甲醇(B),流速:0.3mL/min;梯度洗脫程序:0～1min,20%～35%B;1～4min,35%B;4～5min,35%～60%B;5～6min,60%～70%B;6～7min,70%～20%B。柱溫:30℃,進(jìn)樣量:5μL。電噴霧離子源(ESI),正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),干燥氣溫度:350℃,干燥氣流速:9L/min,霧化氣壓力:275.8kPa,毛細(xì)管電壓:4kV。3結(jié)果與討論3.1與堿的配伍實(shí)驗(yàn)血液樣品含有蛋白質(zhì),直接加入有機(jī)提取溶劑會(huì)導(dǎo)致樣品中蛋白質(zhì)沉淀,提取溶劑不易滲透進(jìn)樣品中;且生物堿一般具有堿性,在堿性環(huán)境下可游離出來(lái),易溶于有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)在提取前加入兩倍量的堿性緩沖溶液稀釋樣品,在提高分散程度的同時(shí)可使生物堿游離出來(lái),加大在有機(jī)相中的分配比例。針對(duì)各生物堿的性質(zhì),考察了以乙醚、乙醚-二氯甲烷(1∶1,V/V)、乙酸乙酯、氯仿、甲醇為提取劑的提取效果,其回收率分別為41.6%～73.9%,57.5%～93.8%,44.4%～86.6%,46.9%～95.5%,81.0%～103.0%?？梢?jiàn),只有用甲醇提取時(shí),8種生物堿的提取回收率都能達(dá)到80%以上,故選擇甲醇為提取劑。3.2流動(dòng)相的組成和ph值對(duì)各組分出峰順序的影響考察了以0.2%甲酸水溶液、10mmol/L乙酸銨溶液和20mmol/L乙酸銨+1%乙酸水溶液為流動(dòng)相A,甲醇和乙腈為流動(dòng)相B的分離效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以10mmol/L乙酸銨水溶液(A)+甲醇(B)為流動(dòng)相可使各組分得到較好的分離和較好的響應(yīng)。采用0.2%甲酸水溶液(pH≈3)與采用10mmol/L乙酸銨溶液(pH≈7)時(shí),各組分的出峰順序發(fā)生改變。A采用前者時(shí)出峰順序?yàn)槊|香堿、麻黃堿、士的寧、阿托品、鉤吻素子、馬錢子堿、烏頭堿、喜樹堿,采用后者時(shí)出峰順序?yàn)槁辄S堿、毛果蕓香堿、阿托品、士的寧、馬錢子堿、鉤吻素子、喜樹堿、烏頭堿,說(shuō)明改變流動(dòng)相的組成和pH值會(huì)影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用,從而改變它們的保留行為。這8種生物堿都具有不同程度的堿性,在pH較高的流動(dòng)相中會(huì)更多地以游離的形式存在,疏水締合作用更強(qiáng);另一方面,喜樹堿、毛果蕓香堿含有內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)、馬錢子堿和士的寧含有雜環(huán)酰胺結(jié)構(gòu),在pH較高的環(huán)境中易開環(huán)形成羧酸鹽,降低與鍵合相的疏水作用,改變保留狀況。兩方面的綜合作用使各組分的保留值隨pH的改變產(chǎn)生不同程度的改變,從而改變出峰順序。3.3流動(dòng)相的處理樣品吹干后用甲醇溶解進(jìn)樣分析,進(jìn)樣2μL以上時(shí),峰展寬現(xiàn)象很嚴(yán)重,峰形不佳;改用梯度洗脫中間段的流動(dòng)相(60%甲醇)溶解,效果有所改善;用起始梯度的流動(dòng)相(20%甲醇)溶解,效果明顯好轉(zhuǎn),進(jìn)樣10μL仍能得到較好峰形。3種情況下進(jìn)樣5μL的MRM色譜圖如圖1所示。從圖1可見(jiàn),用不同溶劑溶解對(duì)先出峰組分的峰形影響較大,后出峰的組分幾乎不受影響,這種情況是由于溶劑效應(yīng)的影響所致。3.4中性破碎的離子對(duì)8種生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)中,除麻黃堿以外,N原子均在環(huán)上,在ESI模式下各組分均易得到一個(gè)H+形成準(zhǔn)分子離子峰[M+1]+,用二級(jí)質(zhì)譜掃描各組分的質(zhì)譜圖如圖2所示。根據(jù)圖2總結(jié)各組分的主要碎片離子及其歸屬如表1。由表1可見(jiàn),各組分的碎裂有以下特點(diǎn):(1)共軛環(huán)中的N上不易發(fā)生碎裂,非共軛環(huán)中和不在環(huán)上的N則易發(fā)生碎裂,如毛果蕓香堿中碎裂不易發(fā)生在N上,而士的寧中m/z為264.3、阿托品中m/z為93.2、麻黃堿中m/z為117.1的碎片均是N上產(chǎn)生中性丟失所得。(2)含有酯結(jié)構(gòu)的組分易發(fā)生氫轉(zhuǎn)移,斷裂丟失羧酸分子,如阿托品中托品酸、烏頭堿中乙酸和苯甲酸的丟失,而當(dāng)含有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)時(shí),則易產(chǎn)生中性碎片CO2或HCOOH丟失,如喜樹堿中CO2的丟失和毛果蕓香堿中HCOOH的丟失。(3)含有羥基和甲氧基的組分易以水和甲醇的形式產(chǎn)生中性碎片丟失,如麻黃堿和烏頭堿中H2O和CH3OH的丟失;而氧雜環(huán)則易開環(huán)以醛的形式產(chǎn)生中性丟失,如鉤吻素子中HCHO和馬錢子堿中C5H4O·的丟失。選擇碎片離子中豐度較大的2個(gè)離子作MRM模式,以響應(yīng)值較高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。各組分的保留時(shí)間、定性離子、定量離子、碎裂電壓、碰撞能量如表1所示。3.5線性范圍、檢出限和定量限取空白血0.5mL,加入8種生物堿標(biāo)準(zhǔn)液混合,配制血中麻黃堿、毛果蕓香堿、阿托品和士的寧濃度為0.01,0.05,0.1,0.5,1,2,5,10,20,50和100μg/L,鉤吻素子、馬錢子堿、喜樹堿、烏頭堿的濃度為0.05,0.25,0.5,2.5,5,10,25,50,100,250和500μg/L,在優(yōu)化的條件下測(cè)定8種生物堿的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(以S/N≥3計(jì))、定量限(以S/N≥10計(jì)),結(jié)果如表2所示。3.6加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)在空白血液中