用于種間雜交遺傳的羅漢果遺傳多樣性分析

用于種間雜交遺傳的羅漢果遺傳多樣性分析

動脈c.弗里奧爾是溫柔的馬蹄蓮科的一種植物。它的果實是傳統(tǒng)中藥,用于治療支氣管炎、急慢性咽喉炎、哮喘和感冒等。羅漢果中所含甜度極高的甜味物質(zhì)是一種低卡路里的理想天然甜味劑(李典鵬等,2000),對肥胖癥、糖尿病患者是理想的糖替代品。廣西北部的永福縣、臨桂縣是傳統(tǒng)的羅漢果產(chǎn)地,是栽培羅漢果的起源地(周良才等,1981),羅漢果是當?shù)氐慕?jīng)濟支柱之一。近年來廣西北部的融安縣、融水縣、龍勝縣和靈川縣的種植面積在逐步擴大,廣東北部和貴州南部也有少量種植。ISSR(inter-simplesequencerepeat)是一種新型的分子標記(Zietkiewicz等,1994),具有很高的穩(wěn)定性和多態(tài)性(Tsumuray等,1996;Fang等,1997),已成功應(yīng)用于某些重要經(jīng)濟植物的遺傳多樣性研究(Blair等,1999;錢韋等,2000;Martins等,2003;馬朝芝等,2003)。對羅漢果的研究主要集中在化學成分、甜味素提取、栽培技術(shù)和病毒防治等方面(李典鵬等,2000;斯建勇等,1996;余麗娟等,2003;杭玲等,2003;蔡健和等,2001),而缺乏在遺傳多樣性方面的研究報道。我們應(yīng)用ISSR分子標記對75份栽培羅漢果樣品進行了分析,目的在于研究栽培羅漢果的遺傳多樣性,為栽培羅漢果種質(zhì)資源的保護和利用提供科學的依據(jù)。1材料和方法1.1樣品采集和處理實驗材料采自廣西永?？h龍江鄉(xiāng)、臨桂縣茶洞鄉(xiāng)和融安縣雅瑤鄉(xiāng)。在每一栽培農(nóng)戶處取樣避免品種重復(fù)(即每個品種只取一份樣品),相同的采集地點同一品種的取樣不超過3份。采集到的植株葉片,插入水中帶回實驗室,存放于-70℃超低溫冰箱中備用?？偣膊杉?5份樣品:雌株樣品62份,其中61份分屬青皮果(Q)、紅毛果(H)、爆棚籽(B)、茶山果(C)、冬瓜漢(D)、馬鈴果(M)、長灘果(T)、拉江籽(La)8個品種,另有1份樣品系不確定,以當?shù)亓晳T花皮籽(Ha)命名;雄株(Y)樣品13份。各樣品的編號和采集地見表1。1.2pcr擴增條件及程序采用CTAB法(Doyle等,1987)提取羅漢果葉總DNA。實驗所用ISSR引物均由上海生工公司合成,引物序列參照加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的第九套ISSR引物序列。從69個引物中選出13個擴增條帶清晰、多態(tài)性帶明顯、背景清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物用于全部75份DNA樣品的擴增,各ISSR引物名稱及序列見表2。ISSR擴增反應(yīng)條件經(jīng)過比較和優(yōu)化確定為25μL的PCR反應(yīng)液內(nèi)含:約30～50ng模板DNA,1UTaq酶,1×PCR緩沖液,2.0mmol/LMgCl2,4種dNTPs各0.2mmol/L,0.5μmol/L引物。PCR擴增程序為94℃預(yù)變性3min,接著進行40個循環(huán):94℃變性1min,52℃退火50s,72℃延伸2min,循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離,用LambdaDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker作為標準分子量對照,溴化乙錠染色,復(fù)日FR-980凝膠成像儀上觀察照相、記錄。1.3電泳譜帶記錄ISSR是顯性標記,同一引物的擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性,按照相同遷移位置上有擴增帶記為1、無帶記為0的方法記錄電泳譜帶,僅清晰、可重復(fù)的并且長度在400～2000bp范圍內(nèi)的擴增帶才被記錄。用NTSYS-pcversion2.02軟件(Rohlf,1998)計算了Nei等(1979)相似性系數(shù),通過該軟件的Eigen程序分別對雌株和雄株做主成分分析(PCA),并進行單株的UPGMA聚類分析。2結(jié)果與分析2.1多態(tài)性引物擴增效果用13個ISSR引物對75份樣品的總DNA進行擴增,所有擴增反應(yīng)均重復(fù)兩次,兩次PCR擴增產(chǎn)物重復(fù)性好且穩(wěn)定,擴增得到的條帶數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)見表2。總共記錄到了88條擴增帶(平均每個引物6.7條),其中64條是多態(tài)性的,多態(tài)條帶比率(PPB)為72.73%。引物UBC811得到的條帶數(shù)最少,為3條;引物UBC840得到的條帶數(shù)最多,為10條。其中引物UBC866擴增得到的帶型見圖版Ⅰ。2.2品種間的遺傳分化根據(jù)得到的0,1矩陣,計算樣品間的Nei和Li相似性系數(shù)。品種及雄株的平均相似性系數(shù)見表3。結(jié)果表明青皮果、紅毛果、爆棚籽的樣品間相似性系數(shù)很高,平均值分別為0.958、0.952和0.988。這三個品種的品種內(nèi)存在多個樣品間沒有遺傳差異的情況:青皮果Q3等5個樣品之間、Q8等4個樣品之間、Q1與Q16及Q11與Q15之間,紅毛果H3等12個樣品之間以及爆棚籽B2等4個樣品之間的相似性系數(shù)為1.0,即無遺傳差異。茶山果、冬瓜漢及雄株的遺傳差異較大,相似性系數(shù)平均值分別為0.879、0.829和0.877;兩個長灘果樣品間的相似性系數(shù)為0.969,而兩個馬鈴果樣品間無差異。為了進一步分析品種及雄株的遺傳分化程度,利用相似矩陣,對雌株的各個品種和雄株進行了主成分分析,第一和第二主成分之和分別解釋總變異的13.59%和41.23%。得到的二維關(guān)系見圖1、圖2。從圖1可以看出:青皮果、紅毛果和爆棚籽的大部分樣品集中分布在各自的區(qū)域,樣品間的差異較小。但是紅毛果的H1、H12、H13和H15以及青皮果的Q4和Q7獨立于各自的集中區(qū)外,說明與品種內(nèi)其他樣品的遺傳差異較大。紅毛果集中分布的區(qū)域較之其他品種距離遠,說明其遺傳關(guān)系較遠;青皮果(除Q4和Q7)和爆棚籽各自集中在相對距離較近的區(qū)域,說明兩者關(guān)系靠近。而茶山果和冬瓜漢的分布松散、范圍較廣,樣品間的差異明顯,遺傳多樣性較高。圖2顯示:13份雄株樣品分布松散,彼此之間的差異明顯,具有較高的遺傳多樣性。2.3水稻紅毛果、山茶果的聚類分析根據(jù)Nei和Li相似性系數(shù)應(yīng)用UPGMA法進行聚類分析,得到的單株遺傳關(guān)系見圖3。結(jié)果表明:青皮果(除Q4和Q7)、紅毛果(除H1、H12、H13和H15)、爆棚籽各自聚為一支,這三分支的節(jié)點具有很高的相似性系數(shù);茶山果、冬瓜漢及雄株的樣品沒有聚類在一起;兩個馬鈴果樣品無差異且與兩個青皮果樣品聚在一起,表明它們有較近的遺傳關(guān)系;兩個長灘果樣品形成分支聚在一起;拉江籽、花皮籽取樣數(shù)少,它們各自獨立出來。3發(fā)酵原料對河流濕地公園的影響據(jù)周良才等(1981)的調(diào)查,當時的主要羅漢果栽培品種有青皮果(占總產(chǎn)量的75%)、長灘果、拉江籽、冬瓜漢和紅毛果,半野生的品種有茶山果和馬鈴果。我們2003年對永福縣龍江鄉(xiāng)、臨桂縣茶洞鄉(xiāng)和融安縣雅瑤鄉(xiāng)的調(diào)查發(fā)現(xiàn),現(xiàn)栽培面積最大的仍是青皮果,紅毛果的栽培面積次之,這兩個品種的栽培面積占95%以上。爆棚籽是近幾年才栽培的一個新品種,它的果形與青皮果相似,其果皮薄而易爆裂,果實的羅漢果甜甙含量相對較低,因其結(jié)實率高、抗病性強而被一些果農(nóng)栽培,栽培面積居第三位。茶山果和冬瓜漢僅有少量栽培。拉江籽和長灘果已很難找到。相對而言,羅漢果的栽培品種資源較為貧乏。ISSR分析結(jié)果表明羅漢果的主要栽培品種青皮果、紅毛果和爆棚籽的品種內(nèi)樣品間的遺傳相似性系數(shù)高,即遺傳多樣性很低。它們的遺傳多樣性很低的現(xiàn)狀與羅漢果的繁殖方法有關(guān)。羅漢果用種子繁殖,其幼苗雄株占70%,且難以鑒別雌雄,產(chǎn)區(qū)果農(nóng)一般不采用。目前普遍采用的繁殖方法是壓蔓繁殖(鐘仕強,1990),壓蔓繁殖是營養(yǎng)繁殖方法,結(jié)果使得許多植株之間沒有遺傳差異。來源于4個村(屬永?？h)的5個青皮果樣品之間和另4個取自2個村(分屬臨桂縣和融安縣)的樣品之間無遺傳差異,它們最終應(yīng)是分別源自同一羅漢果母株;來自9個村(分屬永?？h和融安縣)的12個紅毛果樣品之間也沒有遺傳差異。壓蔓繁殖的結(jié)果使得主要栽培品種青皮果、紅毛果和爆棚籽的遺傳多樣性很低,加速了品種的退化。但也有少量的青皮果和紅毛果植株存在較大的遺傳差異,如樣品Q3和Q7(青皮果)及H1、H12、H13和H15(紅毛果)。這些遺傳差異較大的樣品往往在形態(tài)上有較大的差異,如Q7的果型較大,被果農(nóng)稱為大羅漢果,H12的果呈梨形,H13的果特別長,縱徑可達9cm。這些形態(tài)上差異較大的植株是有用的遺傳資源。茶山果和冬瓜漢具有相對較高的遺傳多樣性。茶山果是指栽培于油茶林中,能自然授粉的羅漢果,屬半野生類型,各地的茶山果是野生移栽,因此在遺傳上它們之間并沒有特別的關(guān)系。果實為冬瓜型的類型統(tǒng)稱為冬瓜漢,我們所調(diào)查采集到的6個冬瓜漢樣