匹魯卡品與戊四氮阻燃模型大鼠行為學(xué)及組織學(xué)改變比較

匹魯卡品與戊四氮阻燃模型大鼠行為學(xué)及組織學(xué)改變比較

癲癇動(dòng)物模型在癲癇的病因、發(fā)病機(jī)制和藥理學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)元丟失及苔蘚纖維出芽是癲癇產(chǎn)生過程中較常見的組織病理學(xué)變化。匹魯卡品(毛果蕓香堿)致癲模型及戊四氮點(diǎn)燃模型均是臨床常用的新生鼠癲癇動(dòng)物模型,兩種模型各有不同特點(diǎn),采用不同的模型可能會(huì)有不同的試驗(yàn)結(jié)果。目前的試驗(yàn)研究大都選擇單一致癲模型,缺少對兩種模型癲癇發(fā)作過程的對比性研究,本研究分別制作兩種癲癇模型,同步觀察兩種模型不同的行為學(xué)特征和組織學(xué)改變,并探討神經(jīng)元丟失及苔蘚纖維出芽在癲癇發(fā)病中改變情況。1水合氯醛單次注射致癲癇模型1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為煙臺(tái)綠葉制藥公司動(dòng)物中心提供,生后1d的SD大鼠60只,隨機(jī)分為鹽水對照組、匹魯卡品組、戊四氮組,每組20只,分別標(biāo)記并與母鼠同籠喂養(yǎng)。匹魯卡品、東莨菪堿、戊四氮均為Sigma公司產(chǎn)品。1.2癲癇模型的制作匹魯卡品組:先予東莨菪堿1mg/kg腹腔注射,以拮抗外周膽堿能反應(yīng),30min后腹腔注射10%匹魯卡品350mg/kg,若注射匹魯卡品后30min無驚厥發(fā)作,再按每次10mg/kg追加匹魯卡品。若驚厥發(fā)作持續(xù)30min仍未停止,則給予水合氯醛400mg/kg腹腔注射,及時(shí)中止發(fā)作。戊四氮組:首次腹腔注射驚厥閾下劑量戊四氮40mg/kg,10min后注射20mg/kg,以后每10分鐘注射10mg/kg,直至出現(xiàn)6、7級(jí)抽搐發(fā)作。急性期誘發(fā)發(fā)作后,每天早7點(diǎn)到晚8點(diǎn)逐只觀察動(dòng)物有無自發(fā)性發(fā)作及動(dòng)物的死亡情況。對照組:給予生理鹽水腹腔注射。1.3Lado幼鼠癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)0級(jí):無發(fā)作;1級(jí):機(jī)械性咀嚼;2級(jí):連續(xù)性點(diǎn)頭;3級(jí):單側(cè)前肢陣攣;3.5級(jí):前肢交替陣攣;4級(jí):雙側(cè)前肢陣攣、后退;5級(jí):雙側(cè)前肢陣攣、后退、摔倒;6級(jí):狂奔嘶叫;7級(jí):強(qiáng)直發(fā)作。1.4病理學(xué)研究將致癇并存活的各組新生大鼠分別于模型成功制作后1d及45d給予水合氯醛腹腔麻醉,灌流固定取腦,在海馬部位做冠狀連續(xù)冰凍切片,切片厚度20μm,每隔1張取片,分別行Nissl染色。首先入二甲苯,然后依次入100%、95%、85%、70%、50%的梯度酒精,蒸餾水浸洗,入1%的甲苯胺藍(lán)染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。1.5苔蘚纖維發(fā)芽檢測取已經(jīng)切好的冰凍切片于黑暗處Timm染色液中孵育,取出切片后沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,玻片覆蓋。半定量評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按苔蘚纖維發(fā)芽量表進(jìn)行。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析匹魯卡品組,匹魯卡品的劑量為370~390mg/kg,誘發(fā)出現(xiàn)發(fā)作的平均時(shí)間為(13.2±2.6)min,動(dòng)物呈現(xiàn)凝視、機(jī)械性咀嚼、連續(xù)性點(diǎn)頭及肌陣攣,無全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作,發(fā)作持續(xù)時(shí)間在5~20min。隨著注射次數(shù)的增加,誘導(dǎo)驚厥發(fā)作的潛伏期縮短,匹魯卡品所需劑量漸小,而發(fā)作等級(jí)發(fā)作程度逐漸增強(qiáng)。停止注射1周后,無再次誘發(fā)情況下未觀察到4級(jí)以上自發(fā)發(fā)作。戊四氮組首次應(yīng)用戊四氮40mg/kg后,均在1~2min出現(xiàn)全身抖動(dòng),軀體游走性痙攣,臀部上翹等表現(xiàn)。重復(fù)注射,動(dòng)物很快出現(xiàn)興奮性極度增高,狂奔、嘶叫、角弓反張,隨即出現(xiàn)全身強(qiáng)直,末梢皮膚發(fā)紺,3~10s后出現(xiàn)節(jié)律性肢體陣攣抽動(dòng),逐漸肌肉松弛,抽動(dòng)減少至停止,整個(gè)過程持續(xù)5~60min。部分新生鼠發(fā)作停止數(shù)分鐘后又再次發(fā)作,如此反復(fù)數(shù)次。對照組無發(fā)作。2.2齒狀回顆細(xì)胞層結(jié)構(gòu)不同實(shí)驗(yàn)組在1d及45d分別進(jìn)行Nissl染色,觀察海馬各區(qū)錐體細(xì)胞層及齒狀回門區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的丟失情況。研究顯示,同一組不同時(shí)點(diǎn)相同區(qū)域神經(jīng)元計(jì)數(shù)無差異,兩個(gè)致癲模型組及對照組CA3區(qū)、CA1區(qū)及齒狀回顆粒細(xì)胞層分別見大量致密的錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞,門區(qū)有中等量神經(jīng)元,排列整齊,形態(tài)完整,胞漿內(nèi)尼氏小體豐富,神經(jīng)元呈藍(lán)色,而背底幾乎無色。與對照組比較,戊四氮組與匹魯卡品組海馬及齒狀回未見明顯神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變和神經(jīng)元丟失。2.3軸突苔蘚纖維入門區(qū)模型制備完成后,不同組齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽的比較發(fā)現(xiàn),兩組均可見齒狀回顆粒細(xì)胞的軸突(苔蘚纖維)進(jìn)入門區(qū),形成一致密的纖維帶緊鄰CA3錐體細(xì)胞層走行,結(jié)束于透明層。根據(jù)苔蘚纖維發(fā)芽評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),戊四氮組CA3區(qū)Timm評(píng)分(1.56±0.08)明顯高于匹魯卡品組評(píng)分(0.55±0.09),差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3苔蘚纖維發(fā)芽是大鼠致癇后的景觀指標(biāo)嚙齒動(dòng)物如同人類一樣,不同年齡階段的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況不同,在研究動(dòng)物癲癇或驚厥發(fā)作模型時(shí)必須考慮年齡或日齡因素。有統(tǒng)計(jì)資料顯示兒童時(shí)期驚厥的發(fā)生率較一般人群高5~10倍,尤以1歲以內(nèi)嬰兒最高,同時(shí)臨床實(shí)踐表明,小兒驚厥的發(fā)生發(fā)展過程包括驚厥的行為特征、腦電圖變化及驚厥預(yù)后等均與成人明顯不同,癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成人。戊四氮癲癇持續(xù)狀態(tài)模型及匹魯卡品點(diǎn)燃模型是常用的新生鼠癲癇模型,兩種模型有不同的特點(diǎn)。本研究同步觀察了兩種模型不同的行為學(xué)特征、癲癇模產(chǎn)生過程中神經(jīng)元的丟失,及苔蘚纖維出芽的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示,匹魯卡品組大鼠通過反復(fù)注射,80%左右的大鼠能夠成功點(diǎn)燃,出現(xiàn)3次以上6或7級(jí)發(fā)作,但20%大鼠出現(xiàn)耐受現(xiàn)象,未出現(xiàn)6或7級(jí)發(fā)作,停止注射1周后,無再次誘發(fā)情況下未觀察到4級(jí)以上自發(fā)發(fā)作。戊四氮組首次應(yīng)用閾下劑量注射,大鼠即迅速出現(xiàn)4級(jí)以上發(fā)作表現(xiàn),重復(fù)注射后,90%左右的大鼠能夠成功點(diǎn)燃,但10%大鼠出現(xiàn)耐受現(xiàn)象,不出現(xiàn)6或7級(jí)發(fā)作。本實(shí)驗(yàn)觀察新生大鼠戊四氮反復(fù)驚厥1d和45d模型的海馬神經(jīng)元形態(tài),未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元明顯凋亡、壞死現(xiàn)象,與匹魯卡品以及對照組相比無明顯差異,神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)CA1、CA3及門區(qū)與對照組也無明顯差異,該結(jié)果與Planas等的研究相吻合。苔蘚纖維發(fā)芽是成熟期癲動(dòng)物模型中普遍存在的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組新生鼠點(diǎn)燃后均可以觀察到苔蘚纖維發(fā)芽,根據(jù)苔蘚纖維發(fā)芽評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)戊四氮組CA3區(qū)Timm評(píng)分明顯高于匹魯卡品組,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,該結(jié)果提示成熟腦和未成熟腦癲癇模型都經(jīng)歷這一病理性改變,表明苔蘚纖維發(fā)芽的確是癲癇病理生理過程中的重要變化。但癲性發(fā)作是否由苔蘚纖維發(fā)芽所致的突觸重組引起,目前尚無明確證據(jù)。綜合以上指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn),新生