帕金森病患者外周血單核細(xì)胞分泌il-6和nf的臨床研究

帕金森病患者外周血單核細(xì)胞分泌il-6和nf的臨床研究

根據(jù)選擇性黑質(zhì)胺神經(jīng)退行性病變的特征性病理改變，尚不清楚帕金森病的病因和發(fā)病機(jī)制，但據(jù)越來(lái)越多的數(shù)據(jù)，細(xì)胞因子作為免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的炎癥介質(zhì)參與了這一過程。其中白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)在帕金森病患者黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元周圍濃度增高,與帕金森病有密切的相關(guān)性。甲磺酸培高利特是一種對(duì)多巴胺D1和D2受體均有活性的多巴胺受體激動(dòng)劑,同時(shí)認(rèn)為其有神經(jīng)保護(hù)作用,在體和離體情況下,也有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。因此,我們?cè)O(shè)想培高利特對(duì)帕金森病患者的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)一定的細(xì)胞因子的分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)的。為證明這一觀點(diǎn),我們于2001年5月至2002年5月進(jìn)行了本項(xiàng)研究。對(duì)象和方法一、分組患者的一般資料及健康對(duì)照情況選擇帕金森病臨床確診的帕金森病患者17例,診斷符合Calne制定的診斷標(biāo)準(zhǔn),且Hoehn-Yahr分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí),根據(jù)服藥情況分為2組,即培高利特+美多芭組和美多芭組,2組患者在實(shí)驗(yàn)開始前已持續(xù)服藥1個(gè)月以上,沒有服用其他抗帕金森病藥物。健康對(duì)照組排除神經(jīng)系統(tǒng)疾患。3組需排除其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾患和感染性疾患,且年齡均≥60歲。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)入組患者及健康對(duì)照者共25例,分別為:培高利特+美多芭組8例,男6例,女2例,平均年齡(72.3±5.1)歲;美多芭組9例,男7例,女2例,平均年齡(71.2±4.9)歲;對(duì)照組8例,男6例,女2例,平均年齡(71.1±3.9)歲。3組間年齡、性別差異無(wú)顯著性(P>0.05)。二、細(xì)胞活力檢測(cè)于上午8∶00時(shí)左右空腹取抗凝肘靜脈血4ml,加2倍量Hank’s液懸浮細(xì)胞,將此懸液加在淋巴細(xì)胞分離液(FicollHypaque,比重1.0770)上,收集血漿與淋巴細(xì)胞分離液交界的外周血單核細(xì)胞(PBMC),將細(xì)胞懸浮于含5%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中計(jì)數(shù)細(xì)胞,同時(shí)用1%臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力,活細(xì)胞數(shù)>95%,再用同樣培養(yǎng)液將細(xì)胞配成4×106/ml。分單純RPMI-1640、加刀豆蛋白A[ConA(含ConA10μg/ml的RPMI-1640)]或加培高利特(含培高利特200pg/ml的RPMI-1640)3種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)。各培養(yǎng)基中加入100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素,分別置于37℃、5%CO2孵育箱內(nèi),一定濕度下孵育42h。分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清液于2ml離心管內(nèi),放置在-80℃冰箱冷凍保存待測(cè)。用比利時(shí)BioSourceEuropeS.A.公司KAC1751TNF-α試劑盒和法國(guó)DIACLONE公司IL-6ELSIA試劑盒進(jìn)行ELISA,采用美國(guó)BioRad公司550型酶標(biāo)儀比色測(cè)定。三、t.不同培養(yǎng)方法之間的t檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進(jìn)行處理,同一樣本的不同培養(yǎng)方法之間作配對(duì)的t檢驗(yàn)。不同樣本相同培養(yǎng)方法之間作組間t檢驗(yàn),P>0.05為無(wú)顯著意義,P≤0.05為有顯著意義。結(jié)果一、3il-6活性見表1。對(duì)照組ConA刺激后IL-6濃度較單純1640培養(yǎng)IL-6濃度顯著增高(P<0.05),而培高利特+美多芭組和美多芭組在增加ConA或培高利特刺激后IL-6濃度較前無(wú)顯著變化。ConA刺激下,IL-6分泌水平培高利特+美多芭組和美多芭組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05,P<0.01),同時(shí)培高利特+美多芭組IL-6濃度顯著高于美多芭組(P<0.05)。培高利特刺激下,培高利特+美多芭組、美多芭組和對(duì)照組IL-6水平,差異無(wú)顯著意義(均為P>0.05)。二、3tnf-檢測(cè)見表1。培高利特+美多芭組ConA刺激下TNF-α濃度較單純1640培養(yǎng)和培高利特刺激均顯著增高(均為P<0.01)。美多芭組ConA刺激下TNF-α濃度較單純1640培養(yǎng)顯著增高(P<0.05)。3種培養(yǎng)基培養(yǎng)后,TNF-α分泌水平培高利特+美多芭組、美多芭組和對(duì)照組3組間比較差異均無(wú)顯著性(均為P>0.05)。早期感染克氏原螯蝦生長(zhǎng)和免疫機(jī)制以往的研究證實(shí),參與帕金森病進(jìn)程的細(xì)胞因子種類很多,其中在神經(jīng)系統(tǒng)IL-6是由星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的,具有促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和再生的功能,且IL-6的分泌存在較明確的中樞和外周調(diào)節(jié)機(jī)制。而TNF-α在帕金森病患者淋巴細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有其特殊受體。依此,研究藥物對(duì)帕金森病患者PBMC分泌IL-6和TNF-α的影響,一定程度上可以反映藥物在中樞的免疫機(jī)制,了解藥物可能的中樞作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,加入ConA刺激后,美多芭組分泌IL-6濃度有所下降,與對(duì)照組比較呈非常顯著性降低,提示帕金森病可能存在PBMC分泌能力降低的免疫缺陷。Hasegawa等認(rèn)為這些缺陷與其他中樞神經(jīng)疾病不同,可能具有一定的疾病特異性,帕金森病中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變誘導(dǎo)了外周免疫功能的變化。與美多芭組不同,加入ConA刺激培養(yǎng)后,盡管培高利特+美多芭組IL-6分泌未達(dá)到對(duì)照組水平,但較美多芭組IL-6的濃度卻顯著增加,提示增加培高利特治療可以部分改善PBMC分泌IL-6的能力,免疫機(jī)制在培高利特治療疾病的過程中可能起一定作用。IL-6分泌的改善,有利于調(diào)節(jié)神經(jīng)元變性后的修復(fù)與再生,提示培高利特可能具有細(xì)胞因子介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。資料顯示,TNF-α在帕金森病患者黑質(zhì)紋狀體區(qū)和腦脊液中濃度增高,TNF-α受體在帕金森病患者黑質(zhì)區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元上具有免疫活性,帕金森病外周血T淋巴細(xì)胞TNF-α受體也有明顯增加。Dobbs等的研究結(jié)果證實(shí),有姿勢(shì)障礙的帕金森病患者外周血清中TNF-α濃度明顯增高。本研究中,在ConA刺激下兩患者組PBMC分泌TNF-α能力,與單純RPMI-1640培養(yǎng)時(shí)比較,明顯提高了,而兩組間無(wú)顯著性差異。此結(jié)果提示:藥物治療的帕金森病患者PBMC體外分泌TNF-α對(duì)有絲分裂原的敏感性增加,增加培高利特治療對(duì)TNF-α分泌無(wú)明顯影響。觀察培高利特體外刺激培養(yǎng)的PBMC分泌TNF-α的濃度,3組之間TNF-α分泌差異無(wú)顯著性,提示培高利特在離體條件下對(duì)帕金森病患者PBMC分泌TNF-α也無(wú)顯著影響。TNF-α具有誘導(dǎo)和促進(jìn)帕金森病患者多巴胺神經(jīng)元變性的細(xì)胞毒作用,而IL-6有利于神經(jīng)元變性后的修復(fù)與再生,Muller等和Wilfried等發(fā)現(xiàn)