實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒DNA的提取與瓊脂糖凝膠電泳修改

實(shí)驗(yàn)11質(zhì)粒DNA的提取與瓊脂1實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法，掌握瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定 A的原理和方法。2實(shí)驗(yàn)原理2.1質(zhì)粒質(zhì)粒（id）是在細(xì)菌中以獨(dú)立于染色體之外的方式存在，是細(xì)菌染色體外的小型雙鏈環(huán)狀NA復(fù)制子。理論上講，所有的細(xì)菌株系都含有質(zhì)粒，有些質(zhì)粒攜帶有幫助其自身從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一個細(xì)胞的信息，即F質(zhì)粒，有些則表達(dá)對一種抗生素的抗性，即R質(zhì)粒，還有一些攜帶的是參與或控制一些不同尋常的代謝途徑的基因即降解質(zhì)粒。質(zhì)粒的大小不定，小的不到kb，大的超過00kb，每個質(zhì)粒都有一段A復(fù)制起始點(diǎn)的序列，它幫助質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制。對細(xì)菌的某些代謝活動和耐藥性表型具有一定的作用。目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀 A分子（簡稱DNA）。細(xì)菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的0.5%?3%。根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質(zhì)量是40x106以上，較小一類的相對分子質(zhì)量是10x106以下（少數(shù)質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量介于兩者之間）。每個細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)胞內(nèi)只有1?2個質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)胞內(nèi)一般有0個左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有 22、 1。 2含有抗四環(huán)素基因（丁或）和抗氨芐青霉素基因（Apr），并含有5種內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。如果將A片段插入切點(diǎn)，不會影響兩個抗生素基因的表達(dá)。但是如果將DNA片段插入到ndIII、BamHI或SalI切點(diǎn)，就會使抗四環(huán)素基因失活。這時，含有 插入片段的 2將使宿主細(xì)菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。沒有插入片段的 2會使宿主細(xì)菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒有R322質(zhì)粒的細(xì)菌將對氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。 1與322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和tI切點(diǎn)。質(zhì)粒運(yùn)載體的最大插入片段約為0kb（kb表示為千堿基對）。EhlyjiiikErQomugSiU圖1.質(zhì)粒作為載體在基因工程中的應(yīng)用應(yīng)用質(zhì)粒作為基因克隆的載體分子，攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，一個重要前提條件是要獲得批量純化的質(zhì)粒NA分子。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括個主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解。在質(zhì)粒A的分離和純化過程中，毫無疑問，宿主細(xì)胞的裂解是分離質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵步驟。常用的質(zhì)粒DNA分離方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法。前兩種方法比較劇烈，它們可以破壞堿基配對，使宿主細(xì)胞的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀 由于拓?fù)淅p繞，兩條鏈不會互相分離。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒的A雙鏈又迅速恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，其大小范圍在1KB至 以上不等。所以，質(zhì)粒 提取與純化是最基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其中，堿裂解法提取的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好，是一種最為常用的方法。2.2堿裂解法堿裂解法提取質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)原理是在pH12.0?12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體 變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒A雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒A仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體A、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒 尚在上清中，收集上清即可得到富集的質(zhì)粒A。近年來，隨著基因治療和 疫苗的發(fā)展，質(zhì)粒逐漸成為一種新型的生物大分子醫(yī)藥產(chǎn)品，藥用質(zhì)粒的大規(guī)模制備成為生物下游過程的重要研究課題。采用此堿裂解法制備高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如pUC系列）時，質(zhì)粒 的產(chǎn)量通常約為3?pg/菌液。隨著生化技術(shù)的發(fā)展，市場上出現(xiàn)了商品化的試劑盒用于提取及純化質(zhì)粒，有些試劑盒采用了傳統(tǒng)的SDS堿裂解法，結(jié)合 制備膜技術(shù)，具有高效、快速、方便之特點(diǎn)。還有些試劑盒利用層析的原理純化質(zhì)粒DNA分子中磷酸二酯鏈骨架在高鹽作用下脫水，使得暴露的磷酸基團(tuán)吸附硅膠，經(jīng)水溶性緩沖液重新水化后，DNA能從層析柱上回收。大多數(shù)試劑盒分離純化的原理為先使經(jīng)過分離的質(zhì)粒A吸附在柱或膜上，然后常規(guī)用乙醇洗滌，最后用水將吸附在柱上或膜上的NA用水溶解下來。實(shí)驗(yàn)中采用的普通質(zhì)粒提取試劑盒為gen普通質(zhì)粒小提試劑盒。下圖為質(zhì)粒DNA制備的原理。

翊脂砰片和大分子/航純性DNA收篥上清琮乙辭.W翊脂砰片和大分子/航純性DNA收篥上清琮乙辭.W■淀，純化原位起蝶健的危恒l>na圖質(zhì)粒DNA制備原理2.3凝膠電泳電泳技術(shù)是分離、純化DNA和鑒定DNA大小的重要方法。生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、多糖等，在一定的H條件下，可以解離成帶電荷的離子。在電場中這些帶電荷的離子，可以根據(jù)電荷的性質(zhì)向正極或負(fù)極移動。這種帶電荷物質(zhì)在電場中向其相反電極泳動的現(xiàn)象稱為電泳。在電泳過程中通常要考慮泳動率，泳動率又稱遷移率，是指帶電荷顆粒單位時間荷單位電場強(qiáng)度下，在電泳介質(zhì)中泳動的距離。泳動率與樣品分子荷電密度、電場中電壓及電流成正比，與樣品的分子大小、電泳介質(zhì)黏度與電阻成反比。不同大小的帶電分子具有不同的泳動率。不同的電泳介質(zhì)具有對樣品不同的分辨效果。在進(jìn)行核酸電泳時，注意 分子的構(gòu)象，在分子質(zhì)量相同時，以高度超螺旋的 泳動速度最快，隨著超螺旋程度降低，相應(yīng) 泳動速度依次變慢，最慢者為線狀雙鏈A。在通常情況下，線狀 分子在一定濃度瓊脂糖介質(zhì)中泳動的速度與其分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。因此，利用 分子長度（bp）的負(fù)對數(shù)與泳動距離作圖，對于片斷分子質(zhì)量測定方便而準(zhǔn)確。緩沖液是電場中的導(dǎo)體，其種類、pH及離子強(qiáng)度會直接影響電泳效果。通常要選擇緩沖離子泳動速度應(yīng)和樣品的泳動速度一致，否則會引起帶型不均一或不對稱峰的出現(xiàn)。在分離核酸時，常選用較高的pH值，使樣品帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。以電泳支持介質(zhì)主要可以分為聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，以電泳方式可以分成垂直型和水平型。一般來說，聚丙烯酰胺凝膠電泳用來分離較短的核酸片斷（5? ），分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳，而后者多用于0.1?60kb的較大核酸片斷。垂直型電泳裝置分離效果比水平型略好，多用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。水平型電泳幾乎為所有的瓊脂糖電泳所采用，其優(yōu)點(diǎn)是灌膠、制板及加樣等操作都較為方便且不會因機(jī)械壓力引起低濃度凝膠的破裂。圖.水平電泳裝置結(jié)構(gòu)示意圖瓊脂糖凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便、快速，分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為0bp至0kb的NA。瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線型高聚物。瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化形成清澈、透明的溶液，然后將溶液倒人膠模中，令其凝固。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在外加電場作用下，帶負(fù)電荷的DNA分子向陽極遷移，遷移速率由以下參數(shù)決定：①DNA的分子大??；②瓊脂糖濃度；③DNA的構(gòu)象；④所加電壓；⑤電場方向；⑥堿基組成與溫度；⑦嵌入染料的存在；⑧電泳緩沖液的組成。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為受DNA的堿基組成或凝膠電泳溫度的影響不明顯，瓊脂糖凝膠電泳一般在室溫下進(jìn)行。瓊脂糖濃度和所加電壓對遷移速率的影響比較值得注意。一個給定大小的線狀NA片段，其遷移速率在不同濃度的瓊脂糖中各不相同，采用不同濃度的凝膠有可能分辨長度范圍廣泛的DNA分子。在低電壓時，線狀片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是，隨著電場強(qiáng)度的增大，高分子量NA片段的遷移率將以不同的幅度增長。因此，隨著電壓的增大，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小。/一微量移液器/樣晶孔T St肢圖.電泳上樣示意圖樣品經(jīng)電泳后形成的條帶必須經(jīng)過染色后才能被顯示出，以進(jìn)行分析和檢測。觀察瓊脂糖凝膠中A的最簡便方法是利用熒光染料進(jìn)行染色。熒光物質(zhì)含有一個可以嵌入堿基之間的平面基團(tuán)，DNA與之結(jié)合后在紫外線照射下呈現(xiàn)熒光。實(shí)驗(yàn)室中最常用的熒光染料是漠化乙錠（EB）。其原理是在紫外線照射時，核酸的吸收波長為4nm的紫外線并將能量傳遞給化乙錠，同時嵌入在核酸堿基間的漠化乙錠吸收nm和6nm波長的紫外線，來自兩方面的能量最終激發(fā)出波長為 m的紅橙色的可見熒光。通常用水將EB配制成lmg/mL的貯存液，于室溫下避光保存。該染料通常以.pg/L的濃度摻人到凝膠和緩沖液里，電泳后直接觀察。也可在不加EB的條件下進(jìn)行凝膠電泳，電泳完成后將凝膠浸在含EE（E.EEpg/EL的電泳緩沖液或水中，于室溫下染色20min左右后觀察。EB的存在將使線狀雙鏈DNA的電泳遷移率降低近％。應(yīng)該注意的是，漠化乙錠是強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性，取用這種染料的溶液時務(wù)必帶上防護(hù)手套。如不慎與皮膚接觸，應(yīng)立即用清水徹底沖洗，含有漠化乙錠的溶液在使用后，不得隨意丟棄。出于安全性的考慮，本實(shí)驗(yàn)對凝膠的染色未采用漠化乙錠，而是選擇了更加安全低毒的 tm核酸料。它是一種新型的核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測NA時， iew與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。經(jīng)過熒光染料染色后的凝膠，在暗室條件下，經(jīng)過紫外燈照射激發(fā)可以出現(xiàn)相應(yīng)的可見熒光。實(shí)驗(yàn)者可通過肉眼或儀器進(jìn)行觀察，紫外線投（反）射儀原理如圖。隨著科技的發(fā)展，各種自動化很高的相關(guān)儀器，設(shè)備相繼問世。這些先進(jìn)儀器的使用使得測量結(jié)果更加接近真實(shí)值，凝膠掃描儀和圖像分析系統(tǒng)就是具有代表性的儀器。凝膠掃描儀主要用來對樣品單向電泳后的區(qū)帶進(jìn)行掃描，從而得出定量的結(jié)果。凝膠掃描儀的出現(xiàn)大大縮短了電泳結(jié)果的分析時間，更主要的是提高了電泳結(jié)果分析的準(zhǔn)確性。掃描儀所得的圖譜通過計(jì)算機(jī)進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)加工處理，提高了數(shù)據(jù)的分辨率、準(zhǔn)確度和靈敏度，特別是在背景扣除、積分方法等數(shù)據(jù)處理上可以根據(jù)情況來選定，從而使得測量結(jié)果與真實(shí)情況更加接近。而圖像分析系統(tǒng)將凝膠譜圖攝制下來，進(jìn)一步將信息數(shù)字化，同時輸入到計(jì)算機(jī)中再進(jìn)行分析，使測定結(jié)果更加迅速、精確。現(xiàn)在的凝膠成像以及圖像分析系統(tǒng)不但可以做蛋白質(zhì)定量，而且也可以做熒光和放射自顯影測量，大大地推動了分子生物學(xué)的研究進(jìn)展。凝膠掃描儀的原理和結(jié)構(gòu)與分光光度計(jì)基本一致。其結(jié)構(gòu)分為光源、單色器（或?yàn)V光片）、樣品室、光電倍增管、結(jié)果顯示等幾部分。樣品室是為專門放置凝膠板而設(shè)計(jì)的。根據(jù)設(shè)置的不同光源，掃描儀可有不同的功能，如為紫外光源，可以掃描未經(jīng)染色的凝膠。而采用可見光源的掃描儀只能對于染色凝膠進(jìn)行檢測。根據(jù)掃描儀視光路的不同，有透射方式測定和反射方式測定兩種，前者能掃描可以透光的凝膠，而后者因光束方向可以改變，則可以掃描不透明的電泳轉(zhuǎn)移膜、層析板等。

打色泄光片a篥外鐫罐射懼h博外域反射位紅色14光升-打色泄光片a篥外鐫罐射懼h博外域反射位紅色14光升-紫外域打暗箱,,.,■■感洗肢片昉盆娘北肢片昭史紫彬MJ2.4大腸桿菌及質(zhì)粒載體大腸桿菌(EscherichiacolLE.coli)是 性短桿菌，大小0.5X1~3革。革身革革，能運(yùn)動，無革革。能發(fā)革多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)革，是人和動物腸革中的正常革革菌，革革出生后即隨革革進(jìn)入腸革，與人終身相，其代謝活動能革制腸內(nèi)分解蛋白質(zhì)的革生物生長，革少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對人體的，還能合成生素B和K，以及有革菌作用的大腸桿菌素。它的主要特點(diǎn)有以下幾點(diǎn)1、大腸桿菌是細(xì)菌，屬于原核生物；具有由革聚糖組成的細(xì)胞革，只含有核糖體簡單的細(xì)胞器，沒有細(xì)胞核有革核；細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運(yùn)載體。2、大腸桿菌的代謝類型是養(yǎng)革性氧型。3、人體與大腸桿菌的關(guān)系：在不致病的情況下（正常狀況下），可病為是互利共生（一般高中段病為是這種關(guān)系）；在致病的情況下，可病為是生4、培養(yǎng)基中加入病紅大腸桿菌，菌病呈病紫色，并有病屬光，可鑒別大腸桿菌是否存在。5、大腸桿菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用：大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，病傳背景清，技術(shù)操作簡單，培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)經(jīng)病，倍受病傳工程專病的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的病選體系。6、大腸桿菌在生態(tài)系統(tǒng)中的地位，病如它生活在大腸內(nèi)，屬于病病者，病如生活在體外則屬于分解者。7、它的基因組DNA為核中的一個環(huán)狀分子。同時可以有多個環(huán)狀質(zhì)粒DNA°TOP10菌株屬于大腸桿菌，它病用于高效勺DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保病高拷貝質(zhì)粒的定傳。質(zhì)粒載體pET系統(tǒng)可以使各種目的蛋白得以最優(yōu)化表達(dá)受噬菌體丁7強(qiáng)轉(zhuǎn)及翻譯（可選擇）信號控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提病的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)°T7RNA聚合酶機(jī)制分有效并具選擇性：病分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細(xì)胞病源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后幾個小時，目的蛋白通?？梢圆〉郊?xì)胞病蛋白的50%以上，但病病分誘導(dǎo)時，能很病病地通過降低誘導(dǎo)物的濃度來病病蛋白表達(dá)。在病誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉病狀態(tài)而不轉(zhuǎn)病用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避病因目的蛋白對宿主細(xì)胞的可能毒性成的質(zhì)粒不定。3實(shí)驗(yàn)材料3.1主要器材電子天平，冰箱，超凈工作臺，搖床，高速離心機(jī)，旋渦振蕩器，制冰機(jī)，病量移液器，病量離心管，病波爐，瓊脂糖凝膠電泳儀（DYY-6C型，北京市六一儀器廠），紫外凝膠成像系統(tǒng)（ -ggms），封口膜，一次性手套。3.2主要試劑（1）菌種：含有28a質(zhì)粒的大腸桿菌Top10，病病霉素抗性，LB液體培養(yǎng)基：酵母浸膏g/L,胰蛋白胨0g/L,NaCl10g/L,pH7.0酵酵霉素：100mg/mLPlasmidminikit質(zhì)粒小量提取試劑盒(Biomig公司)瓊脂糖：電泳級bp,由7條線狀雙鏈 條帶組成，分別為000、、7500、5000、2500、1000和核酸染料(賽百盛)TAE溶液：40mmol/LTris-乙酸鹽，1mmol/LEDTA10x點(diǎn)樣緩沖液(Lgr,a)4實(shí)驗(yàn)方法4.1菌體培養(yǎng)(前酵準(zhǔn)備工作)將pL甘油中保存的菌液接入固體LB平板37^過酵培養(yǎng)，酵取單菌接入10mL液體L培養(yǎng)基(其中酵酵霉素的濃度為50ug/mL),37°C,200rpm過酵培養(yǎng)。4.2質(zhì)粒提取按照smidminikit質(zhì)粒小量提取試^盒(Biomiga公司)進(jìn)行操作：37C過酵培養(yǎng)的！液L rpm離心1min,收集菌體，并酵可能的去除上清，以防止后面菌液裂解不分和沉淀不完全的情況使用250p rA1酵分重懸沉淀；加入250p rB1后反轉(zhuǎn)離心管使液體酵合均勻，然后靜置4min，最好出現(xiàn)溶液酵酵且清的現(xiàn)象，否則可以考慮加大B1的量或者少菌液的量；加入350p冰箱酵酵的 rN1后立即反轉(zhuǎn)多次至溶液酵分勻，出現(xiàn)白色狀沉淀后放置于冰酵上靜置2min室溫下13000rpm離心10min,一次到多次直至上清中沒有沉淀為止，然后將上清轉(zhuǎn)入帶有已平衡好的DNA柱中，放置于收集管中室溫下 rpm離心1min,，重復(fù)兩次后棄濾液；向DNA柱中加入50prKB,室溫13000rpm離心1min,倒酵收集管中的濾液；向DNA柱中加入50p r, rpm室溫離心1min，重復(fù)兩次后棄濾夜；開蓋后室溫rpm離心5min，或者置于超凈臺中 蓋的乙醇，以保蓋最后的洗脫效率；將純化柱置于新的1.5ml離心管中，加入 p蓋熱的或Elutr。室溫下放置2min后3000rpm離心1min，重復(fù)兩次后，收集洗脫液。測定得到的純化產(chǎn)物的濃度，保存于-20°C冰箱中蓋用。4.3瓊脂糖凝膠電泳A制膠a） 利用IxTAE溶液配制0.8%瓊脂糖ml（濃度由目的條帶大小決定），蓋波加熱使之溶化；b） 加入2.5pL iew，輕輕搖勻，避蓋產(chǎn)生泡；c） 將制膠床放入水平放置的制膠托盤中，插好梳子，倒入融好的瓊脂糖凝膠；d） 蓋凝膠蓋分凝固（30min后，拔下梳子。B加樣e） 將制膠床連同凝膠一起放入電泳槽中；f） 加入電泳緩沖液 ，浸沒膠面mm左右；g） 11pL的樣品和IpL點(diǎn)樣緩沖液在封口膜上蓋和，然后點(diǎn)在點(diǎn)樣孔中；h） 將1pL的 r點(diǎn)在點(diǎn)樣孔中。C電泳i） 蓋上透明上；j） 接通電源線，選擇工作電壓，120V， ，打開電泳開關(guān)；k） 當(dāng)加樣緩沖液中的 遷移至夠分離DNA片段的距離時，關(guān)閉電源，將凝膠在紫外燈下觀察，并用凝膠成像系統(tǒng)成像保存電泳圖。（請注意觀察，如蓋蓋蓋已經(jīng)接近另一端時可及時停止）l） 如需要進(jìn)行切膠回收，需要蓋量保目的DNA片段暴露在紫外燈下的時間比較短5注意事項(xiàng)（1） 瓊脂糖溶液波加熱時間不蓋過長，以蓋液體大量蒸發(fā)；（2） 所用器具需要高壓滅菌；（3） 堿裂解過程中蓋和的動作要溫和，切勿振蕩。將融好的凝膠倒入制膠床前需要卻至70°C以下，高溫凝膠會使制膠床變形；凝膠放入電泳槽時點(diǎn)樣孔靠近冷極側(cè)(通電后冷泡較多的一側(cè))；上冷的小凸塊應(yīng)插入槽體，并壓下安全按鈕；本實(shí)驗(yàn)中使用的染色劑的是 ，無毒。但實(shí)驗(yàn)中依然應(yīng)注意手套操作，且接觸染料的手不要隨意接觸其器冷，養(yǎng)成冷好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。6思考題溶液I、II和I中各成分在裂解過程中的作用是什么？沉淀法濃縮核酸可以采用的有機(jī)溶劑有哪些？試分析各種溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)。所提取的質(zhì)粒樣品中可能含有哪些雜質(zhì)，如何去除？質(zhì)粒樣品中含有的各種雜質(zhì)在瓊脂糖中的泳動速度次序？超螺旋、開環(huán)和線性質(zhì)粒的電泳速度次序，凝膠濃度對其影響？除瓊脂糖凝膠電泳之外，質(zhì)粒的分析鑒定方法還有哪些？試分析各種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)。7參考TOC\o"1-5"\h\z⑴ ^ gidDNA.NuclRes,1979,7:1513-1523⑵g . g .L APHY,2005,1069(1):3?22\o"CurrentDocument"⑶ L - .ggflow. L RING,2004,87(3):293?302.\o"CurrentDocument"..ogy,1966,29:234~239.DNA.J.MolBiol,1967,24:203~211J.薩姆克魯克，D.W.拉賽爾著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版).北京：科學(xué)出版社，2002⑺程海.臨床用 A疫苗生產(chǎn)工藝研究進(jìn)展.冷生物冷疫學(xué)進(jìn)展，2006,34(2)：63~66周俊宜.分子生物學(xué)基本技能和策略.北京：科學(xué)出版社，2003趙亞力，馬學(xué)斌，韓為東.分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京：清華大學(xué)出版社，2006欒雨時，包永明.生物工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005張周銘.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊.北京：科學(xué)出版社，2007趙斌，何紹江.周生物學(xué)實(shí)驗(yàn).北京：科學(xué)出版社，2002周德慶.周生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程.北京：高等教育出版社，2006杜連祥，路福平.周生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京：中國輕工業(yè)出版社，2005胡曉燕，張孟業(yè).生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).山東大學(xué)出版社，2005質(zhì)粒小提試劑盒說明質(zhì)粒小提試制盒I簡明步驟（PD12H）（詳細(xì)內(nèi)容博參考英丈說明書）I-實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 .RNaseA:室溫FW槍定貯眥半年■長期忙僦請程于妒C保存.使用神符提供的所有RNgA期時離出后iHABufferAl,便用后將Eu￡eiAlr^lNaseA置于4咬保存_OTAWashBufitr使用前請將8mL（PD1211-00）＞fi6GmL（PDU11-01）或如mLCPD121142J就60mL（PD1211-03）?6-10Q%乙野加AHNAWaztEufier*Bl：在低于室贏時會詛;淀.緒于5此&者水潛加挾至而淀完全溶解.潸模澄清’使用后保此日典丁三1密堇捉蝴&花室疆Fi\進(jìn)忖所有忠心或作.[I.注意事項(xiàng)成也拷頁數(shù)：豌化中低皆CQ的質(zhì)紹Et使用2倍的菌液體壩一2倍的BufferALBLNL相同體映的WashBu±fei4PitutioaBuffer.做化爵若為-WC甘油凍存的菌.請先深布平板培葬后.再重新攜也新的單個菌落堆行墻養(yǎng).切隙盲接取癌存的菌種進(jìn)行墻養(yǎng).[H.攥作步驟L接種新釁的年個菌落到1」血的LB培養(yǎng)基〈含適■抗生素）『37C震擺增葬14M小時.室溫下18伽離心肉鐘，收單茵％卜井盤可能的吸去上清B注，累明的滴體堵罪基容島■仙抽旗翹薛不北加其5步聯(lián)心后慌淀較松，不謎有敦委取Uff.注，豐說嵋與中用推*欄序垣同干株孺邙（LuiiQEartiiLii???F＞：?7F12-15小酎后.。蝠4蛔圜陟度｝H2.0-3.0之間的翻布?看采角的是禰策睹葬基.#1細(xì)匚8或AYR OD^不超芳2.JtltlAZFOrLBufferAl 己加入Rt油eA）,用整波槍或渦流曜蕩充分懸浮細(xì)菌細(xì)胞,注，細(xì)曲絕施如果沒有充分奏浮均可.舞導(dǎo)命弟牛粳解不完全,從而降修產(chǎn)■?JmAM"pLHnfferBL輕牲地反轉(zhuǎn)5一10腹以痕會均制然后期8B分鐘至溶液玷和而橙清-

itc用奶劇烈振iS.靜置時間不超訝5弁鐘.時間過世會導(dǎo)2（基囚甄DNAJ?柴求西利受到tfiM?若溶液秉棒亮澄清，則#叩也懷建解不充如傳1J匚大Ell至rEL的司里或隹少萌棒里，加A350fiLBidfeiNl.MS.轉(zhuǎn)多故至溶液充分混句，此時出現(xiàn)口色黛狀諷淀』將高心曾轉(zhuǎn)至高速高心機(jī).在室濕下13.000ipm高心1。分神（47F.清+TiCfe沉淀?可再次離心）』小心吸晦高心后的上清液至帶有收集管的DNA柱中（避免吸起詛諭）?室溫下13一00。國皿離心1分鐘.恂棹收集管中的廢液,將高心柱重新放回到收集管申”可說：向DNA柱中虹入河0nLBufkLKB.室沮下rpm離心1分鐘?倒掠收集管中的廢液-如高心柱重新放回到收棠管頭注：比擊肘富肯內(nèi)源陵的的宿主齒桌說是必翅的?JilTffilfll,JM11O1,TGlfl：財(cái)旬財(cái)-來說可省略，如氏plgEiH翎宇堵蛋急英文說明書罪壬頁的置2.肘未知的野生曲量好請?jiān)撔写瞬讲僮?S.向離心柱中加入S5DgLDNAUashBuffer（?18己如入無水乙限）,室溫下.13X00ipm高心1分鐘.倒掉收染管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中，重反步驟舞將高心柱放回高速膏心加4<13一的。ipm重噓下開蓋高心Z分鐘.以枷^去除殘壑的乙酬.注：此韋騙而開卷離心將會更有液的去陞尊圖的已醉-乙醇是杏去除「停釁會臥響量岳的卷膛蔻率“19.將高心柱轉(zhuǎn)至?個新的1.5mL^管4向DNAti：的正中間皿入■=0-100pL（體積nSfliiL）的ddHjO<pH在7卜85之間）或EhiiionBuim,'室況放置％}?13,000ipm高心1分鐘，流脫質(zhì)fiDNA.#洗脫戒再加入到I柱中.在13一QWipm離心1分鐘.收:集洗脫屐。也.樁取到的成轉(zhuǎn)口NA可白匿冒干星因克隆.測序、酹用、文就曲選、仲外轉(zhuǎn)錄乖淳、嵯染HZK翌3陽胞.若用于轉(zhuǎn)/內(nèi)為素械罄作汩鹿叛一原代御胞商用于滿汁射-哇議去除內(nèi)雪靠1.^1212）?Bic皿裂E￡取a1' MimpiepKitPage11TroubleSliootingGuideProblemsPossibleRe^0^*:SuggestedIwprav^mentiLowYieldPo