第二節(jié) 聚合酶鏈式反應

第二節(jié)聚合酶鏈式反應

Polymerasechainreaction

PCRContentofTable一、PCR的定義二、PCR技術的優(yōu)點三、PCR原理四、PCR的標準反應體系五、PCR反應五要素六、PCR類型及應用一、PCR的定義在引物指導下由酶催化的對特定克隆或基因組DNA序列進行的體外擴增反應。PCR技術的創(chuàng)建Khorana(1971)等提出在體外經DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。KaryB.Mullis（1944－）二、PCR技術的優(yōu)點特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍三、PCR原理Sample1.denaturatation2.Primerannealing3.PrimerextensionRegiontobecopiedPCR技術原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。模板DNA變性：加熱至94℃左右，雙鏈DNA解離成單鏈；模板DNA與引物的退火(復性)：55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的雙鏈；重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，使DNA擴增量呈指數上升。

PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增PCRproductTargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cyc