大鼠杏仁核點火癲癇后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的表達與定位

大鼠杏仁核點火癲癇后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的表達與定位

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（cnf）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員。它具有廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)作用，可以促進各種神經(jīng)元的生存。nb的功能主要通過受體的tukb來執(zhí)行。近年來，nb在癲癇中的特殊作用引起了人們的關(guān)注。此研究通過建立大鼠杏仁核點燃癲癇模型對BDNF及TrkB的表達進行動態(tài)觀察,以探討B(tài)DNF及TrkB在實驗性癲癇中的作用,并有利于更進一步探討癲癇發(fā)作的多源性調(diào)節(jié)機制。1材料和方法1.1動物點火后時間Wistar大鼠,雌雄不限,體重250～300g,分隔喂養(yǎng),隨機提取。將所有點燃的動物分為以下各組(每組5只):對照組(不做任何處置),手術(shù)對照組(杏仁核下埋置電極,但不予刺激),以及點燃后1(KE1d)、3(KE3d)、7(KE7d)、21(KE21d)和49d(KE49d)組。1.2鼠骨髓內(nèi)固定組用10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛(按體重0.30g/kg)分批麻醉大鼠,在腦立體定位儀下置雙極電極于其右側(cè)杏仁核基底外側(cè)核并固定。坐標(biāo)定位為:前囟后2.0mm,旁開5.0mm,顱骨表面下8.0mm,門齒高于耳根平面5.0mm。固定鐘表螺釘于額竇以接地。將鼠放回籠中單獨飼養(yǎng),術(shù)后每天按體重經(jīng)腹腔注射青霉素80萬U/kg,共5d,以預(yù)防感染。點燃電刺激參數(shù):頻率16Hz,波寬1.0ms,串長10s,強度0.4mA,刺激間隔時間7min。1.3般形態(tài)行為狀態(tài)術(shù)后第7天開始刺激大鼠,同時觀察動物行為反應(yīng)。按Racine分級法,將大鼠行為分為5級:0級,無任何反應(yīng),正常行為狀態(tài);Ⅰ級,濕狗樣顫動,面部痙攣抽動,包括眨眼、動須、節(jié)律性咀嚼等;Ⅱ級,Ⅰ級加節(jié)律性點頭;Ⅲ級,Ⅱ級加前肢痙攣;Ⅳ級,站立并伴雙側(cè)前肢陣攣;Ⅴ級,持續(xù)站立和傾倒,失平衡,四肢抽動。Ⅳ級以上發(fā)作被認(rèn)為是充分點燃。完全點燃的標(biāo)準(zhǔn)是獲得連續(xù)3次Ⅳ級或以上的運動驚厥。1.4細(xì)胞培養(yǎng)及抗氧化活性測定采用SP法。使用鏈霉菌抗生物素蛋白·過氧化酶免疫組化染色超敏試劑盒,用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化酶及基質(zhì)色素混合液測定細(xì)胞和組織中的抗原。嚴(yán)格按說明書步驟進行操作,用PBS代替一抗作陰性對照。1.5吸收值的測量采用日本產(chǎn)LUZEX-F型圖像分析儀測定陽性細(xì)胞的吸光度值[D(λ)]。1.6統(tǒng)計處理采用Excel2000統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間比較采用方差分析,兩組間比較采用t檢驗。2結(jié)果2.1電刺激brnf表達BDNF免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元主要為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。點燃后1d在顳葉及海馬區(qū)BDNF表達即迅速增強并隨癲癇發(fā)作次數(shù)的增加而增強,在7d時表達最強(表1,圖1),點燃后7d由于不再人為給予電刺激BDNF表達逐漸減弱,但在49d時其表達仍強于對照組。經(jīng)方差分析,癲癇鼠顳葉及海馬組織中不同組別BDNF免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元D(λ)值與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其F值分別為9.17(P<0.01)和15.22(P<0.01),對照組與手術(shù)對照組相比,顳葉及海馬BDNF免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元D(λ)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2.2學(xué)校點燃之后7d主要為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。與對照組比較,在點燃后1d大鼠顳葉、海馬免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元增多,表達增強,并隨癲癇發(fā)作次數(shù)的增多TrkB表達繼續(xù)增高,一直持續(xù)至點燃后7d(改變同BDNF),點燃1周后逐漸減少,至點燃后7周時基本恢復(fù)正常(表2,圖2)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方差分析,癲癇鼠不同組別顳葉及海馬TrkB免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元D(λ)值與對照組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,F值分別為24.67(P<0.01)和32.29(P<0.01),對照組顳葉及海馬TrkB免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元D(λ)值與手術(shù)對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及ntfs在cns治療中的作用目前研究證實神經(jīng)營養(yǎng)素家族(neurotrophicfactors,NTFs)系可影響神經(jīng)元發(fā)育、維持神經(jīng)元存活的蛋白質(zhì),它不僅來源于靶細(xì)胞而且來源于支配神經(jīng)元自身,能夠維持神經(jīng)元存活,促進神經(jīng)元生長,并調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育中正常死亡過程。在NTFs中,與其他成員相比,BDNF的分布則相對較廣,除海馬、皮層、杏仁核等腦區(qū)含量較高外,其他腦區(qū)如中腦、下丘腦等均可檢測到。這種現(xiàn)象提示BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)有著不同于其他NTFs成員的特殊作用。癲癇作為一種常見的慢性腦部疾患,腦組織中有許多異常改變在癲癇的產(chǎn)生及反復(fù)發(fā)作中起著重要作用。近年來,實驗動物及人類癲癇灶中均發(fā)現(xiàn)海馬齒狀回苔蘚纖維有芽生現(xiàn)象,并且在這些部位形成異常的突觸。正常情況下這些部位的突觸具有興奮作用,而在癲癇條件下這些部位異常的突觸也具有興奮作用,而這種異常的突觸就可能形成一個正反饋系統(tǒng),對癲癇的產(chǎn)生和反復(fù)發(fā)作起著十分重要的作用,在組織結(jié)構(gòu)上構(gòu)成癲癇發(fā)展和維護的基礎(chǔ)。以往的研究證實,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建是某些類型癲癇的關(guān)鍵特征。而BDNF的主要作用部位是突觸,BDNF參與并調(diào)節(jié)了海馬突觸傳遞和海馬長時程增強(long-termpotentiation,LTP)的形成機制。同時BDNF也參與調(diào)節(jié)成年大鼠突觸的可塑性,海馬內(nèi)微量注射BDNF可引起齒狀回顆粒細(xì)胞突觸的LTP。另一方面,海馬神經(jīng)元表面TrkB受體的數(shù)量可因神經(jīng)元高頻沖動發(fā)放和突觸傳遞而增高,組織化學(xué)及病理學(xué)有關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)癲癇患者的顳葉存在齒狀回顆粒細(xì)胞的苔蘚纖維發(fā)芽,而苔蘚纖維的重建與驚厥反復(fù)發(fā)生有關(guān)。也有學(xué)者提出BDNF與顆粒細(xì)胞“苔蘚纖維”軸突再生即所謂生芽有關(guān)。上述NTFs表達的協(xié)調(diào)性改變表明NTFs可能促進或延緩了癲癇易感性的形成。在癲癇發(fā)作中具有雙重性。目前有關(guān)NTFs在癲癇發(fā)病機制中的具體作用,諸如發(fā)作誘導(dǎo)內(nèi)源性NTFs的表達、合成和釋放的多源性調(diào)節(jié)機制,NTFs在CNS的生化和形態(tài)學(xué)效應(yīng),突觸重建的性質(zhì)、意義以及與NTFs表達的相關(guān)性等均尚未明確,有待進一步探索。在慢性實驗性癲癇中有關(guān)BDNF及其受體的研究較少。此研究采用大鼠杏仁核點燃癲癇模型,應(yīng)用免疫組化方法,探討B(tài)DNF及TrkB的表達定位結(jié)果表明:與對照組比較,在充分點燃的大鼠顳葉、海馬BDNF均有陽性神經(jīng)元表達增多,并隨著癲癇發(fā)作次數(shù)的增加BDNF的表達繼續(xù)增強,點燃7d后由于不再人為給予電刺激BDNF表達增加不明顯,但高表達一直持續(xù)至點燃后49d。其受體TrkB的表達在不同組別與對照組比較均有增強,并隨著癲癇發(fā)作次數(shù)的增多TrkB表達繼續(xù)增高,點燃7d時達高峰,之后逐漸減少,至點燃49d時基本恢復(fù)正常。綜上研究結(jié)果初步認(rèn)為,癲癇發(fā)作后早期BDNF及其受體在CNS的廣泛表達增高是一種內(nèi)源性保護反應(yīng),可防止細(xì)胞死亡,以及用于支持腦損傷后神經(jīng)元的生存。但增高的BDNF可能通過苔蘚纖維的芽生作用而促進點燃的發(fā)生,這種芽生的纖維可導(dǎo)致興奮性增高,即BDNF可能通過介導(dǎo)苔蘚纖維的芽生作用而致癇。另有實驗表明,BDNF可使腦內(nèi)一些生長抑素、神經(jīng)肽Y等興奮性遞質(zhì)明顯升高,而這些遞質(zhì)又具有致癇作用。最近有實驗表明,BDNF可增強突觸的傳遞效率。如Lessmann等報道BDNF可增強培養(yǎng)海馬細(xì)胞谷氨酸能神經(jīng)元的突觸傳遞效率,而谷氨酸反過來又可促進BDNF的合成,因而二者之間形成了一個正反饋系統(tǒng),共同促進癲癇的發(fā)生。BDNF這種表達特異性