丹參粉針劑無(wú)菌檢查方法的初步研究

丹參粉針劑無(wú)菌檢查方法的初步研究

丹參粉針劑是丹參從提取的水溶性冷凍粉末中提取的。具有活血化瘀、理氣通竅的功效，主要用于心絞痛和其他疾病的治療。丹參提取物由于含有多種丹參酮類化合物而顯示出體外對(duì)金黃色葡萄球菌甚至其耐藥菌株的較強(qiáng)抑制作用,這是否會(huì)影響到丹參粉針劑的無(wú)菌檢查及結(jié)果判斷尚屬未知,故本實(shí)驗(yàn)先依據(jù)現(xiàn)行中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行了無(wú)菌實(shí)驗(yàn),建立此類中藥無(wú)菌檢查的有效方法,現(xiàn)報(bào)告如下。1藥品、試劑與儀器硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]均為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;0.9%無(wú)菌生理鹽水(中國(guó)大冢制藥有限公司);去離子水(解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所制水室);丹參粉針劑(批號(hào)020404,020402,020403;哈藥集團(tuán)中藥二廠);HTY-Ⅲ型集菌儀(杭州高得醫(yī)療器械有限公司);LDZX-40BI型全自動(dòng)蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);恒溫培養(yǎng)箱(天津兄弟科學(xué)工業(yè)社);100級(jí)凈化工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠);精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)等。2方法和結(jié)果2.1保鮮劑含菌量的確定取金黃色葡萄球菌的新鮮營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物1白金耳接種于9mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,于30～35℃培養(yǎng)18h,取肉湯培養(yǎng)混合物1mL,以0.9%無(wú)菌生理鹽水遞比稀釋到10-6濃度,取10-3及10-6濃度的稀釋管進(jìn)行活菌記數(shù),并確定其含菌量分別為105～106CFU/mL及10～102CFU/L。2.2接種量不適宜參照中國(guó)藥典2000版一部附錄進(jìn)行。無(wú)菌檢查法抑細(xì)菌實(shí)驗(yàn)表明,按照中國(guó)藥典2000版一部附錄規(guī)定的接種量觀察不到有金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)現(xiàn)象,提示可能直接接種法并不適用于丹參粉針劑的無(wú)菌檢查。進(jìn)一步進(jìn)行體外抗菌、抑菌實(shí)驗(yàn):藥物直接接種法、二倍稀釋法。2.3培養(yǎng)條件優(yōu)化,最小抑制細(xì)菌生長(zhǎng)濃度和殺菌濃度(1)二倍稀釋法抑菌試驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行,并進(jìn)行活菌記數(shù)。(2)藥物直接接種法參照文獻(xiàn)方法,觀察結(jié)果,并進(jìn)行活菌記數(shù),見(jiàn)表1～3。由表1～表3可見(jiàn),二倍稀釋法(硫乙醇酸鹽液體需氣厭氣培養(yǎng)基)結(jié)果顯示其最小抑制細(xì)菌生長(zhǎng)濃度為≤0.098mg/mL,最小殺菌濃度為1.563mg/mL;二倍稀釋法(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基)結(jié)果顯示最小抑制細(xì)菌生長(zhǎng)濃度為≤0.098mg/mL,最小殺菌濃度為0.195mg/mL;藥物直接接種法結(jié)果顯示其最小抑制細(xì)菌生長(zhǎng)濃度為0.156mg/mL,最小殺菌濃度為0.311mg/mL。2.4細(xì)菌回收率測(cè)定(1)薄膜過(guò)濾法試驗(yàn)取丹參粉針劑11支,參照中國(guó)藥典2000版一部附錄進(jìn)行薄膜過(guò)濾法無(wú)菌檢查。(2)薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法修改后進(jìn)行薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。取丹參粉針劑各11支,應(yīng)用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢查,以無(wú)菌操作方法用0.45μm濾膜過(guò)濾,濾膜用0.9%無(wú)菌生理鹽水(50mL×3次)洗滌該膜,在最后1次洗滌時(shí)加入含約100個(gè)左右金黃色葡萄球菌的菌液1.0mL,濾過(guò)后取該膜于30～35℃用平皿培養(yǎng)培養(yǎng)24h并記數(shù),實(shí)驗(yàn)時(shí)同時(shí)取金黃色葡萄球菌液1.0mL用平皿記數(shù),計(jì)算細(xì)菌回收率?；厥章拾凑障旅嬗?jì)算公式進(jìn)行計(jì)算:回收率=濾膜的平均菌落數(shù)/平皿記數(shù)的平均菌落數(shù)×100%。結(jié)果表明用0.9%無(wú)菌生理鹽水(100mL×3次)洗滌濾膜后,陽(yáng)性對(duì)照及樣品陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌都能夠在24h內(nèi)正常生長(zhǎng),且未見(jiàn)有明顯差別,隨后進(jìn)行薄膜過(guò)濾法3次平行的驗(yàn)證試驗(yàn)得到的金黃色葡萄球菌回收率均在80%以上,說(shuō)明可確保其無(wú)菌檢查法采用薄膜過(guò)濾法的有效性。結(jié)果見(jiàn)表4。3未來(lái)研究的方向我們按照中國(guó)藥典2000版一部附錄規(guī)定的接種量進(jìn)行無(wú)菌檢查的預(yù)試驗(yàn)-抑細(xì)菌實(shí)驗(yàn),在陽(yáng)性對(duì)照管呈陽(yáng)性,而陰性對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)的情況下,沒(méi)有觀察到樣品管金黃色葡萄球菌的正常生長(zhǎng)現(xiàn)象,這提示丹參粉針劑對(duì)金黃色葡萄球菌具有較為強(qiáng)大的抑制作用,用直接接種法檢查其無(wú)菌性時(shí)會(huì)造成假陰性的結(jié)果產(chǎn)生,因此直接接種法并不適用于丹參粉針劑的無(wú)菌檢查。為了慎重起見(jiàn),我們應(yīng)用不同的方法進(jìn)行了丹參粉針劑抑菌作用測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其體外具有較強(qiáng)的抗菌、抑菌作用,更加證實(shí)直接接種法不適用于丹參粉針劑的無(wú)菌檢查,可為其對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用及丹參粉針劑的無(wú)菌檢查提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。表4實(shí)驗(yàn)管在培養(yǎng)24h后繼續(xù)培養(yǎng)直到7d,結(jié)果顯示在培養(yǎng)72h時(shí),接種丹參粉針劑量為0.03、0.05均出現(xiàn)渾濁,其余管仍然澄清,表明細(xì)菌生長(zhǎng)受到丹參的抑制,且隨著藥物濃度的增大,該種抑制作用有可能轉(zhuǎn)變?yōu)闅⒕饔?。本研究還表明,丹參粉針劑的無(wú)菌檢查的有效方法為薄膜過(guò)濾法。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)其體外抑制金黃色葡萄球菌的作用并不因?yàn)槠涓邷貪駸釡缇?這提示我們丹參粉針劑的抗菌有效成分為相對(duì)高溫濕熱穩(wěn)定的物質(zhì)。在從事藥品檢驗(yàn)的無(wú)菌檢查工作中,經(jīng)常會(huì)遇到有抑菌作用的中藥注射液及其粉針劑,而目前對(duì)于這方面檢驗(yàn)工作,現(xiàn)行中國(guó)藥典提供的無(wú)菌檢查方法界限較為模糊,標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)際操作中難以把握,我們結(jié)合中藥注射液的體外抗菌作用考察方法