燈盞甘薯注射液體外抗菌活性及其無菌檢查方法的初步研究

燈盞甘薯注射液體外抗菌活性及其無菌檢查方法的初步研究

燈盞細辛注射液是用菊花短杯飛蓬（vat.）鹽提取物提取而成的無菌溶液。主要用于止血、中風、癱瘓和其他疾病的治療。依據現行中國藥典標準對其進行無菌檢查時,結果顯示其對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用,為避免無菌試驗可能造成的假陰性結果而影響判斷,本文分別用不同的方法對其體外抗菌、抑菌作用進行了考察,應用薄膜過濾法對其進行無菌檢查,無菌驗證實驗確定其無菌檢查的有效方法為薄膜過濾法,作者為其它抗菌中藥注射液的無菌檢查提供參考。1藥品、試劑與儀器硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003](中國藥品生物制品檢定所);0.9%無菌生理鹽水(中國大冢制藥有限公司);去離子水(解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所制水室);燈盞細辛注射液(批號:20000301、20000303、20000402,云南生物谷彌勒藥業(yè)有限公司);HTY-Ⅲ型集菌儀(杭州高得醫(yī)療器械有限公司);LDZX-40BI型全自動蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);恒溫培養(yǎng)箱(天津兄弟科學工業(yè)社);100級凈化工作臺(北京半導體設備一廠);精密酸度計(上海雷磁儀器廠)等。2方法2.1保鮮劑含菌量的確定取金黃色葡萄球菌的新鮮營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物1白金耳接種于9ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,于(32.5±2.5)℃培養(yǎng)18h,取肉湯培養(yǎng)混合物1ml,以0.9%無菌生理鹽水遞比稀釋到10-6濃度,取10-3及10-6濃度的稀釋管進行活菌記數以確定其含菌量分別為105～106cfu/ml及10～102cfu/ml。2.2ph測定和調節(jié)按照培養(yǎng)基說明取需要的量用去離子水進行制備,用精密酸度計進行pH測定,必要時進行pH調節(jié),121℃、15min蒸汽滅菌,通過質量考察后在規(guī)定的期限內使用。2.3無菌檢驗法及抗菌實驗參照中國藥典2000版一部附錄進行。2.4無菌試驗2.4.12倍稀釋法參照文獻方法進行,選取硫乙醇酸鹽液體需氣厭氣培養(yǎng)基及營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基,處理方法如表1,并進行活菌記數。2.4.2燈盞細實踐培養(yǎng)參照文獻方法,取裝量為15ml的硫乙醇酸鹽液體需氣厭氣培養(yǎng)基8管,以無菌操作法分別加入燈盞細辛注射液0.1、0.2、0.4、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5ml,另取金黃色葡萄球菌液1.0ml分別加入以上8只培養(yǎng)基管中,混合均勻,于(32.5±2.5)℃培養(yǎng)24h,同時設空白及陽性對照,觀察結果,并進行活菌記數。2.4.3過濾法取燈盞細辛注射液11支,參照中國藥典2000版一部附錄進行無菌檢查。2.4.4細菌回收率測定參照文獻方法修改如下:取燈盞細辛注射液5支,以無菌操作方法用0.45μm濾膜過濾,濾膜用0.9%無菌生理鹽水(50ml×3次)洗滌該膜,在最后一次洗滌時加入含約100個金黃色葡萄球菌液1.0ml,濾過后取該膜于(32.5±2.5)℃用平皿培養(yǎng)24h并記數;實驗時同時取金黃色葡萄球菌液1.0ml用平皿記數,計算細菌回收率?；厥章拾凑障旅嬗嬎愎竭M行計算:回收率(%)=濾膜的平均菌落數/平皿記數的平均菌落數×100%3結果3.1細菌生長和接種量無菌檢查法抑細菌實驗表明,燈盞細辛注射液對金黃色葡萄球菌有較為強大的抑制作用,按照中國藥典2000版一部附錄規(guī)定的接種量陽性對照觀察不到有金黃色葡萄球菌生長現象。3.2細菌培養(yǎng)方法結果無菌檢查法抑細菌實驗提示可能直接接種法并不適用于燈盞細辛注射液法的無菌檢查。為此,我們進一步進行了體外抗菌、抑菌實驗。二倍稀釋法(硫乙醇酸鹽液體需氣厭氣培養(yǎng)基)結果、二倍稀釋法(營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基)結果分別見表2,表3;藥物直接接種法結果見表4。由表2、表3、表4可見:二倍稀釋法(硫乙醇酸鹽液體需氣厭氣培養(yǎng)基)結果顯示其最小抑制細菌生長濃度為(MIC)0.0977%(v/v);二倍稀釋法(營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基)結果顯示其MIC為0.195%(v/v);藥物直接接種法結果顯示其MIC為0.621%(v/v)(即接種量0.1ml時的藥液濃度)。3.3膜過濾法的實驗薄膜過濾法驗證實驗結果見表5。4對細菌的抑制作用及燈盞微細注射液法的消毒處理我們按照中國藥典2000版一部附錄規(guī)定的接種量進行無菌檢查法抑細菌實驗,結果在陽性對照管中沒有觀察到金黃色葡萄球菌的生長現象,這提示燈盞細辛注射液對金黃色葡萄球菌可能具有較為強大的抑制作用,同時也提示可能直接接種法并不適用于燈盞細辛注射液法的無菌檢查。為了慎重起見,我們應用不同的方法進行了燈盞細辛注射液體外抑菌作用測定,進一步的體外抗菌、抑菌實驗顯示其體外具有較強的抗菌、抑菌作用,更加證實直接接種法并不適用于燈盞細辛注射液法的無菌檢查,試圖為其對金黃色葡萄球菌抑制作用及燈盞細辛注射液法的無菌檢查提供依據。表3實驗管在培養(yǎng)24h后繼續(xù)培養(yǎng)至7d,結果顯示在培養(yǎng)72h時,接種燈盞細辛注射液量為0.1、0.2、0.4ml均出現渾濁,表明細菌已經生長,而在燈盞細辛注射液接種體積≥0.6ml的接種管中,始終未見細菌生長現象。盡管不同的實驗方法顯示其最大抑制細菌生長濃度略有差異(見表2、表3、表4),但是以上多次實驗結果同抑細菌實驗一并無疑表明無菌檢查的直接接種法不適用于燈盞細辛注射液法的無菌檢查。取燈盞細辛注射液(批號:20000301;20000303;20000402生產廠家:云南生物谷彌勒藥業(yè)有限公司)各11支,應用薄膜過濾法進行檢查,結果表明用0.9%無菌生理鹽水(100ml×3次)洗滌濾膜后,陽性對照及樣品陽性的金黃色葡萄球菌都能夠在24h內正常生長,目視未見有明顯差別,隨后的薄膜過濾法驗證試驗得到的金黃色葡萄球菌回收率均在80%以上(見表4),確定其無菌檢查的有效方法為薄膜過濾法。文獻報道燈盞細辛注射液主要化學成分為總黃酮,我們在實驗中還發(fā)現其體外抑制金黃色葡萄球菌的作用并不因為高溫濕熱滅菌而改變(見表1處理組的1、2組),說明其抑菌的主要成分可能為對濕熱保持相對