鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在顳葉癲癇模型中的應(yīng)用

鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在顳葉癲癇模型中的應(yīng)用

癲癇（ep）是神經(jīng)系統(tǒng)的第二病，具有復(fù)發(fā)性神經(jīng)元異常痙攣和復(fù)發(fā)性腦癱功能異常的特點(diǎn)，是最常見(jiàn)的難治性ep。由于臨床研究困難、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,因此構(gòu)建動(dòng)物模型是最行之有效的研究方法。為此,我們建立鋰-匹羅卡品小鼠EP模型,觀察其行為學(xué)改變,并且應(yīng)用ZnSe金屬自顯影技術(shù)(AMG)檢測(cè)苔蘚纖維出芽情況,以探討其有無(wú)類(lèi)似于人類(lèi)顳葉EP的行為學(xué)及病理學(xué)特征。1材料和方法1.1模型小鼠行為檢測(cè)雄性CD-1小鼠35只,體重18-22g,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。分籠飼養(yǎng),常規(guī)飲食。隨機(jī)分為對(duì)照組5只和模型組30只,后者又分3d、7d、15d、30d、60d五個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只小鼠。鋰-匹羅卡品模型組小鼠首先經(jīng)腹腔注射氯化鋰(0.13g/kg),18~24h后注射硫酸阿托品(1mg/kg),30min后再注射匹羅卡品(150mg/kg)。給藥小鼠在15~30min后出現(xiàn)反復(fù)強(qiáng)直-陣攣發(fā)作,即癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus,SE)。于SE后90min,腹腔注射地西泮(10mg/kg),終止SE,降低死亡率。觀察小鼠行為變化。對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水,余同實(shí)驗(yàn)組。1.2根據(jù)語(yǔ)言分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)作小鼠在腹腔注射匹羅卡品后觀察其行為學(xué)變化,參考Simialowski6級(jí)(0-V)評(píng)定法。0級(jí):無(wú)任何發(fā)作跡象;Ⅰ級(jí):凝視,頭面部輕微顫動(dòng);Ⅱ級(jí):點(diǎn)頭或WDS(濕狗樣抖動(dòng))、搔抓;Ⅲ級(jí):前肢局限性驚厥;Ⅳ級(jí):具有后肢站立的全身強(qiáng)直性驚厥;Ⅴ級(jí):具有站立伴摔倒全身強(qiáng)直一陣攣性發(fā)作。連續(xù)3次以上出現(xiàn)4~5級(jí)發(fā)作,即被認(rèn)為達(dá)到SE。1.3動(dòng)物標(biāo)本的采集小鼠在腹腔注射致SE后,在不同時(shí)間點(diǎn)(3d、7d、15d、30d、60d)對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)行取材。動(dòng)物首先經(jīng)腹腔注射0.1%硒酸鈉(15mg/kg),存活1.5h后腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物,然后用蠕動(dòng)泵經(jīng)左心室灌注生理鹽水和2.5%戊二醛150ml,取大腦,2.5%戊二醛后固定3h。標(biāo)本置于30%蔗糖液4℃冰箱保存過(guò)夜。恒冷箱制備10μm的冰凍切片,切片置于AMG孵育液并在恒溫(26℃)振動(dòng)水浴箱內(nèi)孵育60min,封片后,X在光鏡觀察。2結(jié)果2.1小鼠癲癇發(fā)作的一般情況SE模型行為學(xué)改變主要分3期。急性期:腹腔注射15-30min后,小鼠出現(xiàn)凝視、濕狗樣震顫、眼裂變大、雙眼球突出、陣發(fā)性頭面部輕微顫動(dòng)、節(jié)律性點(diǎn)頭、雙側(cè)前肢局限性驚厥、可伴口中流涎。隨時(shí)間延長(zhǎng),小鼠可出現(xiàn)發(fā)作性劇烈狂奔、跳躍、跌倒,并出現(xiàn)伴后肢站立甚至站立后摔倒的全身強(qiáng)直性驚厥發(fā)作。發(fā)作時(shí)頭部后仰、全身肌肉劇烈抽搐、四肢強(qiáng)直、尾部上翹、口吐白沫,持續(xù)約1分鐘。最終反復(fù)發(fā)作達(dá)到SE。潛伏期:在SE后2~14d為潛伏期,主要表現(xiàn)為精神萎靡、進(jìn)食活動(dòng)少、消瘦,但無(wú)癲癇自發(fā)發(fā)作表現(xiàn)。慢性期:在SE后15~60d為慢性期,小鼠出現(xiàn)癲癇的反復(fù)自發(fā)發(fā)作,最初多為局部性發(fā)作如前肢陣攣或面部抽搐,很快發(fā)展至全身強(qiáng)直性驚厥發(fā)作,一般持續(xù)時(shí)間不超過(guò)1min,發(fā)作均可自行終止。生理鹽水組未見(jiàn)發(fā)作。2.2小鼠偶見(jiàn)少數(shù)苔蘚纖維進(jìn)入內(nèi)分子層正常生理鹽水對(duì)照組、SE后3d的小鼠海馬齒狀回內(nèi)分子層未見(jiàn)到AMG染色的棕黑色顆粒(圖1-4);SE后7d的小鼠偶可見(jiàn)少數(shù)苔蘚纖維穿過(guò)顆粒細(xì)胞層進(jìn)入內(nèi)分子層(圖5、6);SE后15d、30d及60d的小鼠可見(jiàn)大量苔蘚纖維穿過(guò)齒狀回顆粒細(xì)胞層到達(dá)內(nèi)分子層,并逐漸在此處形成一條深染的致密層狀帶(圖7-12)。3纖維出芽動(dòng)力學(xué)改變匹羅卡品是膽堿能毒蕈堿類(lèi)受體激動(dòng)劑,能激發(fā)腦內(nèi)乙酰膽堿能受體,激活谷氨酸興奮通路誘發(fā)SE,導(dǎo)致海馬等易損區(qū)的興奮毒性損害;此外,匹羅卡品能激活NMDA受體、代謝性谷氨酸受體,從而激活了腦內(nèi)興奮性系統(tǒng),出現(xiàn)了EP的發(fā)作。而氯化鋰對(duì)匹羅卡品的致癇過(guò)程有協(xié)同作用,可減少匹羅卡品的用量,減輕其毒副作用,降低致癇小鼠的死亡率。因此本研究聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰、匹羅卡品作為造模藥物,而且成功誘導(dǎo)了小鼠出現(xiàn)SE發(fā)作。合格的EP動(dòng)物模型首先要具有與人類(lèi)顳葉EP相似的臨床特點(diǎn)即:EP發(fā)作時(shí)出現(xiàn)典型的行為學(xué)改變;在腦部受損傷后,在出現(xiàn)臨床自發(fā)性EP癥狀之前存在一個(gè)潛伏期,可數(shù)天、數(shù)月或數(shù)年。本研究中發(fā)現(xiàn),在腹腔注射匹羅卡品后,小鼠的行為學(xué)改變急性期表現(xiàn)為典型的EP發(fā)作癥狀,最初為1-3級(jí),如雙側(cè)前肢局限性驚厥等,之后發(fā)作級(jí)別逐漸上升,直至出現(xiàn)SE造成腦損傷。在SE后2~14d進(jìn)入潛伏期,表現(xiàn)為精神萎靡、但無(wú)EP自發(fā)發(fā)作表現(xiàn)。在SE后15~60d進(jìn)入慢性期,小鼠出現(xiàn)反復(fù)EP自發(fā)發(fā)作,一般持續(xù)時(shí)間不超過(guò)1min,發(fā)作均可自行終止。這些行為學(xué)改變與已往的大鼠EP模型的研究結(jié)果一致,與人類(lèi)顳葉EP極其相似。苔蘚纖維出芽是人類(lèi)顳葉EP的典型病理學(xué)特點(diǎn)。苔蘚纖維(MF)是海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的軸突。正常情況下,MF與門(mén)區(qū)中間神經(jīng)元及CA3區(qū)錐體細(xì)胞的樹(shù)突建立神經(jīng)聯(lián)系;當(dāng)CA3區(qū)錐體細(xì)胞和門(mén)區(qū)神經(jīng)元被致癇損傷后,內(nèi)分子層失神經(jīng)傳入,MF也與靶細(xì)胞斷離,因而觸發(fā)MF異常出芽回返入內(nèi)分子層并與該層顆粒細(xì)胞的樹(shù)突建立異位突觸。本研究中也發(fā)現(xiàn),在SE后3天及7天時(shí),海馬齒狀回內(nèi)分子層未見(jiàn)明顯的苔蘚纖維出芽,從第15天開(kāi)始,海馬齒狀回內(nèi)分子層有明顯的苔蘚纖維出芽,到30天及60天時(shí)出芽更加明顯,而對(duì)照組卻未見(jiàn)苔蘚纖維出芽。這與Sankar等的研究結(jié)果相符,證實(shí)了該模型Figs.Nomossyfibersproutingwasobserved(1,2)intheinnermolecularlayerincontrolandon3thdayafterinjectionofpilocarpine(3,4).Mossyfibersproutingwasoccasionallyobservedintheinnermolecularlayeron7thdayafterinjectionofpilocarpine(5,6).Mossyfibersproutingwasconspicuouslyobservedintheinnermolecularlayeron15thdayafterinjectionofpilocarpine(7,8),withalotofAMGpositivegranulesalmostdistributingcontinuously.Mossyfibersproutingwasconspicuouslyobservedinthemolecularlayeron30thdayafterinjectionofpilocarpine(9,10),withlotsofAMGpositivegranulesdistributingcontinuously.Mossyfibersproutingwasconspicuouslyobservedintheinnermolecularlayeron60thd