DNA重組技術(shù)的基本工具(上課)

選修三現(xiàn)代生物科技專題教學(xué)目標(biāo)：簡(jiǎn)述DNA重組技術(shù)所需要三種工具的作用；認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開(kāi)理論研究和技術(shù)創(chuàng)新教學(xué)重點(diǎn)：DNA重組技術(shù)所需要三種工具的作用教學(xué)難點(diǎn)：基因工程載體需要具備的條件1指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程原理基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組基因工程蘇云金芽孢桿菌體內(nèi)有一種毒蛋白基因，它編碼的蛋白質(zhì)可以使害蟲死亡，但對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)毒害作用。棉花常常因害蟲而減產(chǎn)。能讓棉花擁有該基因變成抗蟲棉就好了——要實(shí)現(xiàn)它大致應(yīng)該怎么操作、可能需要什么工具？同學(xué)們討論一下。問(wèn)題探討：如何將蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)的抗蟲基因從它的DNA分子中切割下來(lái)？如何將切下來(lái)的抗蟲基因與運(yùn)載體DNA連接起來(lái)？如何將重組的DNA運(yùn)送到棉花細(xì)胞？需要切割DNA的工具（分子手術(shù)刀）需要連接DNA片斷的工具

（分子縫合針）需要基因轉(zhuǎn)移的工具（分子運(yùn)輸車）

——限制性核酸內(nèi)切酶——DNA連接酶——基因載體思考識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。主要是原核生物4000種。1、來(lái)源：2、種類：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶黏性末端平末端專一性

1、大腸桿菌的一種限制酶（EcoRⅠ)能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)形成黏性末端。2、SmaⅠ能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切割形成平末端。常見(jiàn)的兩種限制酶EcoRIAAGTTCCTTAAGCTTAAGGAATTC識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)限制酶在切斷DNA時(shí)，可在切口處帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間堿基正好互補(bǔ)配對(duì)，因此稱這些片斷為黏性末端。AATTGCCTTAAG3’5’3’3’5’5’5’3’AATTGCCTTAAGSmaⅠCCCGGGGGGCCC識(shí)別GGGCCC序列，并在G和C之間切開(kāi)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。CCCGGGGGGCCC

現(xiàn)有一長(zhǎng)度為1000堿基對(duì)(bp）的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用Kpn1單獨(dú)酶切得到400bp和600bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同時(shí)酶切后得到200bp和600bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子。該DNA分子的酶切圖譜正確的是練一練限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須用限制性核酸內(nèi)切酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端。思考

用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵？4個(gè)CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA2、DNA連接酶三、基因工程的基本工具類型來(lái)源功能相同點(diǎn)差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)閱讀課本第5頁(yè)“DNA連接酶——分子縫合針”的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái)催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，DNA連接酶的縫合作用T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但連接平末端的效率較低DNA連接酶的縫合作用

用DNA連接酶連接兩個(gè)相同的黏性未端要形成幾個(gè)磷酸二酯鍵？2個(gè)下圖為三種限制酶BamHⅠ、Hind

Ⅲ和BglⅡ的識(shí)別序列及切點(diǎn)。它們切割出來(lái)的黏性末端可以互補(bǔ)配對(duì)的是：GGATCCCCTAGGAAGCTTTTCGAAAGATCTTCTAGABamHⅠHind

ⅢBglⅡGCCTAGGATCTAGATCCGATCTAG√√鞏固提高DNA聚合酶和DNA連接酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位雙鏈在兩DNA片斷之間形成磷酸二脂鍵單鏈將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸片斷3’末端形成磷酸二脂鍵基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

要讓一個(gè)從甲生物細(xì)胞內(nèi)取出來(lái)的基因在乙生物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，首先得將這個(gè)基因送到乙生物的細(xì)胞內(nèi)去！能將外源基因送入細(xì)胞的工具就是運(yùn)載體。假如外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制會(huì)怎樣？作為載體如果沒(méi)有限制酶切割位點(diǎn)將怎樣？外源基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何去察覺(jué)？如果載體對(duì)受體細(xì)胞有害將怎樣？會(huì)在細(xì)胞增殖中丟失

外源的基因不可能插入

如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，就可通過(guò)標(biāo)記基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)。

將影響受體細(xì)胞新陳代謝，進(jìn)而使轉(zhuǎn)入的外源基因也可能無(wú)法表達(dá)。三、基因工程的基本工具3、基因載體（運(yùn)載體）

作為載體的必要條件1.能自我復(fù)制能進(jìn)入受體生物細(xì)胞并在受體生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)；2.有一個(gè)至多個(gè)限制酶切位點(diǎn)能與目的基因結(jié)合3.有遺傳標(biāo)記基因便于觀察4.對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害、易分離安全、比較容易得到大腸桿菌結(jié)構(gòu)模式圖DNA質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)模式圖目的基因插入位點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因復(fù)制原點(diǎn)一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因可以復(fù)制對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害真正被用作載體的質(zhì)粒，都是進(jìn)行過(guò)人工改造的。三、基因工程的基本工具3、基因載體（運(yùn)載體）

質(zhì)粒（最常用）、λ噬菌體的衍生物和某些動(dòng)植物病毒種類：不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制（）

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)4、下面是四種不同質(zhì)粒的示意圖，其中ori為復(fù)制必需的序列，amp為氨芐青霉素抗性基因，tet為四環(huán)素抗性基因，箭頭表示一種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。若要得到一個(gè)能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的含重組的細(xì)胞，應(yīng)選用的質(zhì)粒是(

)C基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)或多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物

、動(dòng)植物病毒課堂小結(jié)：到哪里去找限制酶呢？生物易受外來(lái)DNA的入侵，比如病毒的入侵。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中生物形成了一套完善的防御機(jī)制，比如動(dòng)物有專門的免疫系統(tǒng)。而原核生物用來(lái)防止外來(lái)病原物的侵害的防御性工具就是限制酶，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割、使之失效，以保證自身的安全。那限制酶不會(huì)剪切細(xì)菌本身的DNA嗎？P7第2題通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，當(dāng)細(xì)菌中含有某種限制酶時(shí)，細(xì)菌本身的DNA分子中通常不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列。這樣，細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。

補(bǔ)充知識(shí)點(diǎn)：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)28①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子29真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不