樺褐孔菌總黃酮雪花膏的制備及性能研究

樺褐孔菌總黃酮雪花膏的制備及性能研究

樺樹開花菌是一種寄生在落葉樹上的菌，主要寄生在白樺、銀樺、楊樹等樹干和樹皮下，形成副作用的木腐菌。子實體是腫瘤，直徑25.40厘米，黑色，深入裂紋，不規(guī)則。子的橢圓形和橢圓形是光滑的，有光澤和毛茸茸的。細菌肉是紅茶。細菌管3.10mm，脆脆，前端開裂，菌孔6.8mm，圓形。樺褐孔菌的菌絲體極其耐寒,能耐受-40℃的低溫,主要分布在北緯45～50°的北美、俄羅斯的西伯利亞、波蘭、芬蘭、中國黑龍江和吉林、日本北海道等地區(qū)。樺褐孔菌是一種民間藥用真菌,東歐等多國廣泛利用它來防治糖尿病、心臟病、癌癥等各種疑難雜癥,還可以抑制艾滋病病毒,抗輻射,抗有絲分裂、消除其活性等。樺褐孔菌富含黃酮成分。黃酮類物質(zhì)又稱作類黃酮物質(zhì),是色原烷或色原酮的衍生物,是以α-苯基苯并吡喃酮為主體的一系列物質(zhì)的總稱。黃酮類化合物具有抗衰老、抗腫瘤、抗氧化以及降血脂等多種生物活性,其中一種主要的生物活性是抗氧化作用,也就是減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基。自由基對人體具有一定的生理作用,但體內(nèi)自由基過多,就有可能會導(dǎo)致細胞或組織損傷、誘發(fā)多種疾病、加速動物機體的衰老。正常情況,人體自由基的生成和清除處在一個動態(tài)平衡。當機體處于某些疾病或外源性物質(zhì)的入侵時,自由基的代謝會發(fā)生異常,產(chǎn)生過多自由基,而過多的自由基會造成體內(nèi)氧化應(yīng)激,引發(fā)疾病。若此時人體內(nèi)的抗氧化物不足,無法清除過多的自由基,就會導(dǎo)致人體健康受損。作者從樺褐孔菌中提取總黃酮,并進行樺褐孔菌總黃酮雪花膏的抗氧化試驗,為進一步研究樺褐孔菌總黃酮的生物活性和綜合開發(fā)利用樺褐孔菌資源提供理論依據(jù)。1實驗部分1.1主要設(shè)備和試劑1.1.1儀器、試藥與儀器RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;美的KJ23B-DE第Ⅱ代微波爐,最大輸出功率800W,廣東省佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司;UV-1100型紫外可見分光光度計,上海美普達儀器有限公司;GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風干燥箱,上海汝源機電設(shè)備有限公司;DZF-6050型真空干燥箱,上海雷韻試驗儀器制造有限公司;飛鴿牌TGL-16G高速冷凍離心機,北京海誠中儀科技有限公司。蘆丁標準品,購自上海源葉生物科技有限公司;丙二醛(MDA)測定試劑盒、羥自由基測定試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.2試驗動物大白鼠,體質(zhì)量130～160g,SPF級,SCXK-(閩)2008-0001,購自廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。1.2實驗方法1.2.1標準曲線及合作標準方法的確定樺褐孔菌菌種由河北省科學(xué)院微生物研究所提供。將保存菌種接種在PDA試管綜合培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0g·L-1,葡萄糖20.0g·L-1配制)上,在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～9d,活化后備用。采用液體培養(yǎng)法,用打孔器打下大小均勻一致的活性好的樺褐孔菌菌種接入液體培養(yǎng)基上,裝入量為300mL的三角瓶裝入150mL液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)1d后轉(zhuǎn)恒溫培養(yǎng)振蕩器上振蕩培養(yǎng)(溫度28℃,轉(zhuǎn)速130r·min-1)。當菌絲體處于生長末期,發(fā)酵液傾出上清液,抽濾機抽濾后放烘箱中烘至恒重,烘箱溫度為60℃。標準曲線的繪制:精確稱取已烘干至恒重的蘆丁標樣20.00mg,微熱溶解于體積分數(shù)為60%的乙醇溶液中,并定容至50mL,搖勻,即得質(zhì)量濃度為0.4g·L-1的蘆丁標準液。準確量取蘆丁標準液0,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0mL分別于25mL容量瓶中,然后各加入1.0mL質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO2溶液,搖勻,放置6min。加入1.0mL質(zhì)量分數(shù)為10%的AlCl3溶液,搖勻,放置6min。再加入10.0mL質(zhì)量分數(shù)為4%的NaOH溶液。最后用體積分數(shù)為60%的乙醇溶液稀釋至刻度,搖勻,放置15min。以試劑空白為參比,在510nm處測定吸光度,繪制標準曲線,得到回歸方程為Y=4.3622X-0.0142,相關(guān)系數(shù)r=0.9996。式中Y為吸光度,X為黃酮質(zhì)量濃度(g·L-1),n=6。樺褐孔菌總黃酮的微波提取:選擇乙醇體積分數(shù)、料液比(g∶mL)、微波輻射時間、微波輻射功率為考察因素,選用L9(34)正交表進行試驗(見表1),確定樺褐孔菌總黃酮微波提取的較佳提取工藝條件。總黃酮提取率=黃酮類化合物質(zhì)量/干物料質(zhì)量×100%。1.2.2酪氨酸酶法合成mllvain緩沖液在5組質(zhì)量濃度為0.024g·L-1的不同體積(分別為5.0,7.0,7.5,8.0和12.0mL)的樺褐孔菌總黃酮提取液中加入0.025g酪氨酸和4mLpH=6.8的磷酸-檸檬酸mcllvains緩沖液,在37℃恒溫水槽中預(yù)熱10min,再加入4mL酪氨酸酶水溶液(以mcllvains緩沖液配制成0.05g·L-1),充分攪拌,于37℃反應(yīng)15min后,測定其在475nm處的吸光度A1。另外,不加樺褐孔菌總黃酮提取液進行上述試驗,測得吸光度A2。作為對照,在不加樺褐孔菌總黃酮提取液和酪氨酸的條件下再進行上述試驗,測得吸光度A3。計算樺褐孔菌總黃酮對酪氨酸酶活性的抑制率I:I=(A2-A1)/(A2-A3)1.2.3樺褐孔菌總黃酮提取液tween油相:硬脂酸甘油酯3.00g,羊毛脂1.50g,蓖麻油3.00g,十六醇1.50g,十八醇2.50g;水相:三乙酸胺0.50g,甘油5.0g,Tween800.50g,蜂蜜1.00g,尼泊金乙酯0.30g,水30.00g,香精;質(zhì)量濃度為0.024g·L-1的樺褐孔菌總黃酮提取液。前3相在水浴中從常溫升到90℃,保持20min殺菌,將油相倒入水相(油相、水相都要保持均勻)。將不同體積的樺褐孔菌總黃酮提取液加入油相和水相的混合物中,攪拌,冷卻至50℃,加入防腐劑,香精,調(diào)節(jié)pH=6.0～6.5(在50℃之前調(diào)好),取出放至室溫,配制成一系列樺褐孔菌總黃酮雪花膏,并進行功能性測試。1.2.4溫度穩(wěn)定性將產(chǎn)品倒入3支洗凈的干燥試管中,高度約80mm,1支放入40℃的恒溫冰箱中,1支放入-5℃的恒溫冰箱中,24h后取出,待恢復(fù)室溫后將其與第3支試管(存放于室溫)中的樣品進行比較,觀察其對溫度的穩(wěn)定性。并進行提取液與雪花膏的相容性試驗。1.2.5樺褐孔菌總黃酮雪花膏對正常大白鼠皮膚組織勻漿的穩(wěn)定性的影響實驗將40只大白鼠分成4組,每組10只,去其背部被毛,暴露面積約為6cm2,前3組用0.024g·L-1的樺褐孔菌總黃酮提取液加入量為0,7.5和8.0mL所配的雪花膏每天涂抹一定時間,30d后處死,取背部皮膚組織勻漿,第4組不做雪花膏涂抹實驗。制備10%皮膚組織勻漿液,分別測定樺褐孔菌總黃酮雪花膏對正常大白鼠皮膚組織勻漿中MDA的含量。具體方法參照MDA測定試劑盒說明書。1.2.6酶活力的測定超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的測定參照鄰苯三酚微量進樣法,測定波長為325nm,溫度為25℃,SOD酶活力單位采用U表示。鄰苯三酚自氧化速率的測定:參照文獻,在試管中加入緩沖液(0.1mol·L-1的Tris-HCl,pH=8.2,內(nèi)含2mmol·L-1的EDTA),于25℃恒溫水浴中保溫20min,然后加入鄰苯三酚(對照管用10mmol·L-1的HCl代替鄰苯三酚),迅速搖勻,立即傾入比色杯,在325nm波長下測定吸光度A,每隔30s讀數(shù)1次,連續(xù)測2min,要求自氧化速率控制在0.070A·min-1。SOD或粗酶抽提液的活性測定方法與測定鄰苯三酚自氧化速率相同。酶活力單位定義:在一定條件下,1mL的反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個活力單位。每毫升酶液活性單位(U?mL?1)=v0?v150%v0×V×(N/V1)(U?mL-1)=v0-v150%v0×V×(Ν/V1)式中v0為鄰苯三酚自氧化速率;v1為酶樣液氧化速率;V為反應(yīng)液總體積;N為酶樣液稀釋倍數(shù);V1為酶樣液體積。1.2.7皮膚組織勻漿中羥自由基清除能力的測定按照羥自由基測定試劑盒說明書的方法,測定體外皮膚組織勻漿液在550nm處的吸光度,并計算皮膚組織勻漿中羥自由基清除能力。具體方法參照羥自由基測定試劑盒說明書。2結(jié)果與討論2.1工藝條件優(yōu)選如表2所示,各因素對總黃酮提取率的影響程度依次為:微波輻射功率>料液比>乙醇體積分數(shù)>微波輻射時間;較佳的工藝條件為A2B1C1D2,即乙醇體積分數(shù)為70%,料液比(g∶mL)為1∶40,微波輻射時間為120s,功率為352W。在較佳提取工藝下進行3次重復(fù)試驗,最高提取率為4.96%。2.2美白劑的活性測試酪氨酸酶是黑色素細胞合成反應(yīng)的限速酶,具有酪氨酸羥基酶和多巴羥基酶2方面的活性。酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴,多巴轉(zhuǎn)化生成多巴醌,多巴醌呈紅褐色,在475nm處有最大吸收,利用分光光度計測定加入美白劑和未加美白劑反應(yīng)中生成多巴醌的變化來檢測美白劑對酪氨酸酶活性的抑制率。樣品對酪氨酸酶活性的抑制率越高,美白效果越明顯。表3結(jié)果表明,質(zhì)量濃度為0.024g·L-1的樺褐孔菌總黃酮提取液加入量為7.5mL時,酪氨酸酶活性的抑制效果較好,抑制率為25.0%。2.3不同結(jié)構(gòu)黃酮雪花膏的其它性能所制備的雪花膏在室溫,40和-5℃存放24h后發(fā)現(xiàn)無分層、沉淀、變色現(xiàn)象,由此可見樺褐孔菌總黃酮雪花膏的耐熱、耐寒性能好,對溫度較穩(wěn)定。由表4可以看出,樺褐孔菌總黃酮提取液對雪花膏的穩(wěn)定性、光澤、氣味、顏色、pH影響不大,可見樺褐孔菌總黃酮提取液與其他組分有很好的相容性。質(zhì)量濃度為0.024g·L-1的樺褐孔菌總黃酮提取液用量為7.5mL時制成的雪花膏的色澤等效果最好。2.4皮膚組織勻漿中mda含量的變化現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為,皮膚老化是自由基產(chǎn)生和消除發(fā)生障礙的結(jié)果。機體每天代謝時產(chǎn)生的自由基分子在正常情況下可被清除,但年齡的增長可以加速氧自由基的形成。自由基形成后,其代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量明顯增高,MDA為極活潑的交聯(lián)劑,它能使真皮結(jié)構(gòu)發(fā)生大分子交聯(lián),使真皮纖維扭曲、增粗、紊亂,使人的皮膚在外觀上日見衰老。其吸光度值A(chǔ)的高低可間接表征物質(zhì)的抗脂質(zhì)過氧化(即抗MDA生成)活性,A值越小,表明物質(zhì)的抗脂質(zhì)過氧化能力越強;反之,則抗脂質(zhì)過氧化能力越弱。如表5所示,與對照組(無涂抹雪花膏)相比,涂抹了雪花膏的大白鼠皮膚組織勻漿中MDA含量顯著減少;并且在涂抹了雪花膏的大白鼠中,隨著樺褐孔菌總黃酮提取液用量增加,大白鼠皮膚組織勻漿中MDA含量顯著減少,加入質(zhì)量濃度為0.024g·L-1的樺褐孔菌總黃酮提取液分別為7.5和8.0mL時,MDA生成抑制率分別為45.87%和52.98%,與不加樺褐孔菌總黃酮提取液的相比,差異均達到極顯著水平(P<0.01),表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系?？梢娸^高濃度的樺褐孔菌總黃酮可增強MDA生成的抑制率。2.5劑量-效應(yīng)關(guān)系研究超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,能清除超氧陰離子自由基(O2-·),其在生物體內(nèi)的水平高低是衰老與死亡的直觀指標。如表6所示,與對照組(無涂抹雪花膏)相比,涂抹了雪花膏的大白鼠皮膚組織勻漿中SOD活性顯著增強;并且在涂抹了雪花膏的大白鼠中,隨著樺褐孔菌總黃酮提取液用量增加,大白鼠皮膚組織勻漿中SOD活性也增加,加入質(zhì)量濃度為0.024g·L-1的樺褐孔菌總黃酮提取液分別為7.5和8.0mL時,SOD活性分別為144.69和160.15U·mL-1,與不加樺褐孔菌總黃酮提取液的相比,均達到極顯著差異(P<0.01),并表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。說明隨樺褐孔菌總黃酮濃度的增加,大白鼠皮膚的SOD活性有明顯地增強。2.6皮膚組織勻漿中羥自由基清除能力的變化羥自由基(·OH)是生物體內(nèi)危害最大、活性最強的自由基,它可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用,造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷,使細胞壞死或突變,其還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬等有關(guān)。因此,清除羥自由基能力是反映試樣抗氧化作用的重要指標。如表7所示,與對照組(無涂抹雪花膏)相比,涂抹了雪花膏的大白鼠皮膚組織勻漿中羥自由基清除能力顯著增強;并且在涂抹了雪花膏的的大白鼠中,隨著樺褐孔菌總黃酮提取液用量增加,大白鼠皮膚組織勻漿中羥自由基清除能力均有顯著增強,也表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。說明隨樺褐孔菌總黃酮濃度的增加,清除羥自由基的作用有明顯地增強。3結(jié)論1樺褐孔菌總黃酮雪花膏乙醇體積分數(shù)為70%,料液比(g∶mL)為1∶40,微波輻射時間為120s,功率為352W;最高提取率為4.96%。樺褐孔菌總黃酮具有一定的抑制酪氨酸酶活性的能力,在一定濃度梯度的酪氨酸酶抑制試驗中,7.5mL樺褐孔菌總黃酮提取液抑制效果最好,抑制率為25.0%。樺褐孔菌總黃酮雪花膏的物理性能測試顯示,當加入質(zhì)量濃度為0.024g·L-1的樺褐孔菌總黃酮提取液7.5mL時,該雪花膏對光照較為穩(wěn)定,耐熱、耐寒性能良好;且雪花膏的