實驗一-植物細胞有絲分裂及染色體行為的觀察

遺傳學實驗指導教師：劉振蘭

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生命科學學院北樓607室顯微鏡使用注意事項每次使用之后要登記（登記本在顯微鏡下的抽屜里,請注意你使用的顯微鏡后面的編號和記錄本上面的編號要一致）；使用完后請把載物臺按逆時針方向調到最低位置,4X物鏡放到光路中間，并將電壓調至最?。徊灰蟿语@微鏡，如需調整位置請搬動顯微鏡的底部抬起移動；請不要使用100X油鏡去觀察樣品!!!顯微鏡是貴重儀器,請大家小心愛護使用。謝謝!遺傳學是一門實驗性的學科。它的每一步發(fā)展都是以實驗作為基礎的。因而實驗教學是教學中非常重要的組成部分。通過實驗課我們要學習什么？遺傳學基礎實驗方法的訓練和基本規(guī)律的驗證－基本技能的訓練；實驗設計能力和科學研究素質的培養(yǎng)；強調理論與實踐相結合，培養(yǎng)和鍛煉學生用所學知識解決實際問題的能力。參考書目《遺傳學分析實驗教程》喬守怡主編，高等教育出版社2008年1月第一版；《遺傳學綜合實驗》李雅軒、趙昕主編，科學出版社2006年5月第一版；《遺傳學實驗技術》盧龍斗、常重杰主編，科學出版社2007年9月第一版；《遺傳學綜合實驗》劉祖洞、江紹慧編，高等教育出版社1987年11月第二版。課程評價成績主要由課程考勤、上課表現(xiàn)和實驗報告三部分組成。請認真獨立的完成實驗報告，嚴禁抄襲及杜撰實驗數(shù)據(jù)！請用華南農業(yè)大學實驗報告紙；實驗報告的內容：實驗目的實驗原理主要試劑及材料實驗步驟實驗結果與分析（請用鉛筆繪圖）作業(yè)及思考題當節(jié)課的實驗報告下次課交上來。實驗報告的要求植物遺傳學系列動物及醫(yī)學遺傳學系列微生物遺傳學系列果蠅遺傳學系列數(shù)量與群體遺傳學系列分子遺傳學系列遺傳學實驗的內容植物細胞有絲分裂及染色體行為的觀察（316）植物細胞減數(shù)分裂及染色體行為的觀察（316）果蠅的飼養(yǎng)及形態(tài)觀察（324）果蠅的有性雜交（設計性實驗）（324）植物有性雜交技術（田間試驗）輻射誘變對染色體結構的影響（316）人工誘發(fā)多倍體植物（316）大腸桿菌乳糖操縱子基因的表達調控（324）實驗一植物細胞有絲分裂及染色體行為的觀察有絲分裂中的紡錘體

一、實驗目的學習和掌握植物染色體壓片法；觀察植物細胞有絲分裂過程中染色體的形態(tài)特征和動態(tài)變化，識別有絲分裂的不同時期。二、實驗原理動植物的許多組織細胞都進行有絲分裂。高等植物的根尖和莖端分生組織，高等動物的骨髓和一些上皮組織，都是觀察有絲分裂現(xiàn)象的適宜部位。由于各個細胞的分裂是獨立進行的，因此在同一組織中可以看到不同分裂時期的細胞。通過觀察各個時期內染色體（或染色質）的存在狀態(tài)，就可以判斷這些細胞各處于有絲分裂的哪個時期，進而認識有絲分裂的完整過程。通過有絲分裂和細胞分化，DNA準確地在細胞世代間相傳，實現(xiàn)組織發(fā)生和個體發(fā)育。

三、實驗步驟取材固定解離染色壓片操作鏡檢

1.取材

本實驗以洋蔥為材料，在室內(25度)培養(yǎng)根尖。用廣口瓶裝滿水，把洋蔥放在瓶口上，使洋蔥的鱗莖盤與水充分接觸，每天換水促進生長，生根前去掉洋蔥外面干燥膜狀鱗葉，以免污染瓶水，抑制生根。

不定根1.5-2cm時取材固定或進行預處理。洋蔥根尖細胞以上午6-9時為分裂高峰期。根尖由于取材方便，是觀察植物染色體最常用的材料。根尖染色體壓片法，是觀察植物染色體最常用的方法，也是研究染色體組型、染色體分帶、染色體畸變和姐妹染色單體交換的基礎。2.固定

采用滲透力強的固定液將植物組織、細胞迅速殺死，使蛋白質沉淀，使植物材料保持原有狀態(tài)。固定方法：將植物材料用蒸餾水沖洗2次→轉移到卡諾氏固定液中→固定3～24h。固定后的材料可以轉入70%乙醇溶液中,在4度冰箱中保存，但保存時間最好不超過2個月。固定的目的：迅速防止細胞死亡后的變化，防止自溶、腐敗，盡量保持生長狀態(tài)結構；使細胞中的蛋白質、脂肪、糖、酶等成分轉變?yōu)椴蝗苄晕镔|，以保持活體的形態(tài)；使組織內各種物質成分產生不同的折光率，便于觀察和鑒定；使不同組織成分對染料有不同的親和力，便于染色；防止細胞過度收縮或膨脹，失去原有的形態(tài)結構。3.解離常用酸解法和酶解法；酸解法：固定后的材料用清水沖洗，放入1mol/L的HCl中60℃處理5～10min。注意：掌握好溫度和時間，若解離時間不夠，則壓片不易分散；解離時間過長，下一步處理時由于材料過軟而易將根尖丟失。解離的目的是使分生組織細胞間的果膠質分解,細胞壁軟化或部分分解,使細胞和染色體容易分散壓平。酸解優(yōu)點：制片清潔，染色體清晰，組織軟化好，易于壓片。缺點：染色體較軟，容易纏繞，不易分散；對小型染色體的材料效果較差。注意：酸解是本實驗成敗的關鍵之一。酸解溫度應保持在60（上下浮動不超過0.5度），如果溫度過低或時間過短，酸解不夠，醛基暴露不充分，染色會過淺；若溫度過高或時間過長，會造成酸解過度，使DNA完全解聚，糖與醛基之間的鍵被破壞，游離的核酸分子會擴散到細胞質中，從而造成染色淺或不均一的現(xiàn)象。酸解法是用鹽酸水解根尖，步驟簡便、容易掌握，廣泛應用于染色體計數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察。根尖分生組織經(jīng)過酸解和壓片后，都呈單細胞，但是大部分分裂細胞的染色體還包在細胞壁中間。4.染色解離后的材料用蒸餾水沖洗，將根冠和伸長區(qū)切除，只留分生區(qū)部分→將根尖置于載玻片上，加一滴染色液，5～10min。5.壓片操作蓋上蓋玻片，在酒精燈火焰上過3～4次，以手背感覺玻片微燙為宜。此步驟是使材料更易軟化和著色，并破壞部分細胞質使染色背景清晰。若室內氣溫較高或認為染色效果較好，也可省去此步驟。用左手拇指壓住蓋玻片的一角，右手拿鉛筆（橡皮頭朝下）垂直敲蓋玻片幾下，將材料震散。注意用力均勻，確保兩玻片不錯動，將材料壓成薄薄一層，即可放在顯微鏡下觀察。6.鏡檢壓好的片先在低倍鏡下鏡檢，找到分裂細胞后，再轉換成高倍鏡觀察染色體動態(tài)變化。如果染色體分散良好，圖像清晰，可以進行顯微照相保存。一個解離良好的材料，只要用鑷子尖輕輕敲打蓋玻片，分生組織細胞就可以鋪展成薄薄的一層，再用毛邊紙把多余的染色液吸干，經(jīng)顯微鏡檢查后，選擇理想的分裂細胞，再在這個細胞附近輕輕敲打，使重疊的染色體漸漸分散，就能得到理想的分裂相。注意事項壓片材料要少，避免細胞緊貼在一起，致使細胞和染色體沒有伸展的余地；解離時間不可過長，以免染色體結構受損；解離后水洗要徹底，否則不易著色；用鑷子敲打蓋玻片時，用力要均勻，若在壓片時稍不留意，會使個別染色體丟失，而被迫放棄一個良好的分裂相細胞；防止出氣泡。作業(yè)及思考題繪出在顯微鏡下觀察到的有絲分裂各時期的示意圖。為了便于觀察有絲分裂的過程及其中染色體的動態(tài)變化，最好應該選擇什么樣的材料，為什么？你觀察到的洋蔥染色體有絲分裂以什么時期為最多？染色體和染色質互變、染色體加倍各發(fā)生在什么時期？醋酸洋紅將洋紅粉末1g倒入100mL45%醋酸溶液中，邊煮邊攪拌，煮沸(沸騰時間不超過30s)，然后懸入一生銹的小鐵釘于染液中，過1min取出，或加入1%～2%鐵明礬水溶液5-10滴，至此液變?yōu)榘导t色而不發(fā)生沉淀為止。靜置12h后，過濾于一棕色試劑瓶中，儲存?zhèn)溆谩Ｅ渲品椒ǎ合扰涑扇N原液,再配成染色液

原液A:3g堿性品紅溶于100ml70%酒精中.

原液B:取原液A10ml加入到90ml5%石炭酸水溶液中.

原液C:.取原液B55ml,加入6ml冰醋酸和6ml福爾馬林(38%的甲醛).

(原液A和原液C可長期保存,原液B限兩周內使用).

染色液:取C液10—20m1,加45%冰醋酸80～90ml,再加山梨醇1.8