土壤真菌：多樣性和檢測(cè)

土壤真菌：多樣性和檢測(cè)摘要：大部分目前命名和描述的80，000多真菌物種的生命周期似乎只在土壤環(huán)境中的某些階段才會(huì)發(fā)生。因此，真菌在土壤中具有很多不同的功能，包括活躍角色，例如降解死亡植物組織；或不活躍角色，作為休眠的土壤中出現(xiàn)的繁殖體。目前土壤真菌多樣性的影響的知識(shí)主要基于對(duì)環(huán)境中出現(xiàn)的真菌體的觀察，或者來(lái)自于土壤分離培養(yǎng)所得。這兩種方法無(wú)論對(duì)于任何一種環(huán)境來(lái)說(shuō)，檢測(cè)其真實(shí)的真菌多樣性都存在巨大的缺陷。如果子實(shí)體沒(méi)有形成，只是土壤中出現(xiàn)了菌絲體，通過(guò)直接觀察的方法似乎不能進(jìn)行鑒定。因此，傳統(tǒng)的通過(guò)直接顯微鏡觀察會(huì)大大降低環(huán)境中真實(shí)的多樣性。從土壤中分離培養(yǎng)真菌只能檢測(cè)那些可以在分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和產(chǎn)生孢子的繁殖體。這也將會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)到的多樣性大大降低，因?yàn)槟壳耙阎目沙晒ε囵B(yǎng)的真菌大概只有17%。從土壤中恢復(fù)培養(yǎng)真菌也無(wú)法區(qū)分真菌在原來(lái)的生態(tài)系統(tǒng)中是活躍的還是處于休眠期。分子技術(shù)的發(fā)展提供了觀察和研究土壤環(huán)境中明確的相互作用和活力的一系列新的工具。廣譜PCR檢測(cè)結(jié)合SSCP或者DGGE可以為生態(tài)系統(tǒng)多樣性基本問(wèn)題提供更加準(zhǔn)確的答案。但是，這些技術(shù)不能區(qū)分活的和休眠期的物種，因此為了更好的理解其結(jié)果，需要對(duì)這些微生物的生態(tài)學(xué)和功能進(jìn)行推理和演繹。簡(jiǎn)介真菌是微生物的一個(gè)巨大多樣性組合體，包括一系列大型形式，從顯微鏡單細(xì)胞酵母到體積龐大的大型菌，例如大家熟知的蘑菇、羊肚菌、大型子實(shí)體和巨大馬勃菌。最新公布的真菌物種估計(jì)數(shù)量報(bào)道有72065種涵蓋11個(gè)門(mén)7745個(gè)屬。新的真菌物種在不斷的被描述，每年大概有2000種，根據(jù)真菌索引種類(lèi)等級(jí)大約80-10000個(gè)真菌物種。但是，這些物種只是目前分離和描述的，我們?nèi)圆淮_定到底有多少真菌種屬還沒(méi)檢測(cè)到。據(jù)Hawksworth估計(jì)還有100萬(wàn)種未被描述，Driver和Milner認(rèn)為大概接近50萬(wàn)種與昆蟲(chóng)有關(guān)。這看起來(lái)似乎大部分真菌物種生命循環(huán)的一部分在土壤環(huán)境中或與土壤環(huán)境有關(guān)。它們?cè)谕寥乐械淖饔脴O為復(fù)雜并且對(duì)于土壤生態(tài)系統(tǒng)十分重要。然而，評(píng)估土壤中真菌的絕對(duì)數(shù)量和種類(lèi)卻十分困難，因?yàn)槭芊蛛x和檢測(cè)土壤真菌方法的局限，盡管相當(dāng)?shù)囊恍┓N類(lèi)已經(jīng)從土壤中分離出來(lái)并報(bào)道了。至今沒(méi)有土壤中物種數(shù)量的關(guān)鍵評(píng)估。Gilman包括了700個(gè)物種，盡管這些只包括土壤稀釋后非選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的物種，并且排除了陸生的巨型真菌和植物病原菌。許多物種包括在Barron、Domsch和Watanabe等編纂的書(shū)里。Watanabe認(rèn)為從土壤中分離出的真菌至少有1200種。確切的檢測(cè)一個(gè)土樣中存在哪種真菌是一項(xiàng)很困難的任務(wù)，一個(gè)最主要的問(wèn)題是大部分的物種不可培養(yǎng)。這是一個(gè)眾所周知的現(xiàn)象，事實(shí)上，評(píng)估顯示，已知的真菌只有17%才可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。如果這個(gè)數(shù)字用在Wantanabe建議的1200種上面，那么土壤真菌應(yīng)該有7000種左右。另外，雖然一些土壤棲居真菌可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是大多數(shù)情況下它們不能長(zhǎng)出休眠結(jié)構(gòu)，例如孢子，因此，只有營(yíng)養(yǎng)菌絲可以用來(lái)詳細(xì)分析。一些更普通的土壤真菌培養(yǎng)方法將在后面提到。傳統(tǒng)的土壤真菌多樣性的指標(biāo)是土壤中含有的子實(shí)體的數(shù)量和變化。就像前面提到的，真菌子實(shí)體變化巨大，例如巨型馬勃菌通常直徑一米或更大，而通常的蘑菇和蕈菌，細(xì)微結(jié)構(gòu)只有幾微米，例如許多子囊菌。而且，盡管在土壤環(huán)境中可以檢測(cè)出許多子實(shí)體，但是大部分土壤真菌是以休眠體（孢子）或者菌絲體的形式出現(xiàn)。有很多文獻(xiàn)提到個(gè)別土壤樣品中真菌種類(lèi)的數(shù)量，這些數(shù)據(jù)隨土樣不同變化巨大，報(bào)道的最高值是66900m/1g干土。菌絲體和抱子可以從土壤中分離出來(lái)，但是如果樣品或培養(yǎng)基中沒(méi)有相關(guān)聯(lián)的子實(shí)體，那么微生物的鑒定機(jī)會(huì)很困難，通常不可能。功能和作用與土樣中單一真菌相關(guān)的菌絲體數(shù)量是相當(dāng)大的。拿菌根真菌來(lái)說(shuō)，單一的網(wǎng)絡(luò)就可能覆蓋植物根部系統(tǒng)的大部分。拿自由生活的土壤真菌來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的仙人圈是由標(biāo)記在單菌絲微生物外圍的一系列的子實(shí)體所構(gòu)成。通過(guò)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究鑒定得出的目前已知的最大的這種微生物是Armillariabulbos并且已知在美國(guó)的密歇根州至少有15公頃。后來(lái)一篇未經(jīng)證實(shí)的報(bào)道稱(chēng)鑒定出更大的A.ostoyae在美國(guó)的華盛頓州有600公頃。最近，經(jīng)證實(shí)的報(bào)道稱(chēng)在Malheur國(guó)家森林發(fā)現(xiàn)了更大的覆蓋880公頃的真菌。在這種情況下，像仙女環(huán)這種真菌的生長(zhǎng)和蔓延明顯是菌絲體。然而，邊緣的的子實(shí)體產(chǎn)生大量的孢子，但是它們?cè)诼雍臀⑸锷L(zhǎng)中的作用卻很少有人研究。土壤中孢子在真菌繁殖中的作用在各個(gè)類(lèi)群之間有所不同。阻止油掌腐爛的靈芝，它們的繁殖被認(rèn)為是通過(guò)連接掌的根部的菌絲生長(zhǎng)。但是，隨后的研究對(duì)這個(gè)假定產(chǎn)生的質(zhì)疑，他們認(rèn)為可能是孢子形成了這種真菌繁殖的重要部分，即使在相對(duì)局限性的種群中。在異擔(dān)子菌中，菌絲生長(zhǎng)和孢子繁殖都會(huì)發(fā)生在當(dāng)?shù)胤N群中，孢子繁殖在入侵管理森林的樹(shù)樁時(shí)十分重要，根部的菌絲生長(zhǎng)在林齡較大的已形成的自然森林中很重要。Christensen描述了真菌的20種功能，其中最主要的一項(xiàng)功能是作為土壤中的主要降解者。對(duì)于這種傳統(tǒng)的生命循環(huán)是在土壤中的有機(jī)物上作為菌絲生長(zhǎng)，因此導(dǎo)致在表面或者地下形成子實(shí)體。許多土壤真菌還有其他的功能和相互關(guān)系，其中研究最廣泛的是菌根。菌根關(guān)系多變并且它們可能和植物直接共生，以幫助植物種子萌芽或者通過(guò)生態(tài)位排斥來(lái)阻止病原菌入侵。真菌菌根的關(guān)系從極端的植物和真菌的自生關(guān)系到只在宿主植物組織細(xì)胞內(nèi)表面寄生的內(nèi)生菌根。真菌菌根的關(guān)系特異性也是變化很大。當(dāng)許多菌根真菌可以和許多不同的宿主形成關(guān)系同時(shí)，其它的則是宿主特異性或宿主嚴(yán)格限制性的，例如紅菇屬。另外，在一個(gè)單一的植物宿主根圍可能供養(yǎng)著大量不同的菌根真菌。土壤真菌也有很多其它的相互作用和關(guān)系，例如作為植物、節(jié)肢動(dòng)物、線蟲(chóng)或者真菌類(lèi)的病原體。反過(guò)來(lái)，它們也可能是作為節(jié)肢動(dòng)物和其他無(wú)脊椎動(dòng)物的食物，或者被致病性的細(xì)菌攻擊。不管怎樣，真菌在土壤中既以活躍的生命有機(jī)體存在，也以潛伏的繁殖體存在。后者可能有它們與非土壤環(huán)境有關(guān)的基本的生命循環(huán)，土壤作為中間的儲(chǔ)備。其中蟲(chóng)霉真菌提供了一個(gè)例子。這些是結(jié)合真菌，它們是許多節(jié)肢動(dòng)物尤其是雙翅目和同翅目的病原菌。蟲(chóng)霉的孢子在節(jié)肢動(dòng)物上發(fā)芽，然后菌絲侵入宿主。被入侵的節(jié)肢動(dòng)物有一種走向更高的植物表面的趨勢(shì)，此時(shí)形成的真菌就通過(guò)吸器將死亡的節(jié)肢動(dòng)物和植物結(jié)合在一起。然后釋放孢子，其中一大部分進(jìn)入土壤，它們?cè)谟龅叫碌乃拗饕郧耙廊皇切菝郀顟B(tài)。因此，土壤真菌可能被敘述為可以活躍的自由生長(zhǎng)、與其他微生物或休眠體密切相關(guān)的一系列大量的為微生物。這些真菌如果產(chǎn)生子實(shí)體或者其他復(fù)雜結(jié)構(gòu)就可以被常規(guī)的鑒定出來(lái)。但是任意給定土樣中假定出現(xiàn)的大量真菌卻不能通過(guò)傳統(tǒng)的技術(shù)鑒定出來(lái)。分子技術(shù)由于形態(tài)學(xué)技術(shù)不能充分的確定和描述真菌，因此導(dǎo)致了分子方法的發(fā)展。如今，分子技術(shù)已經(jīng)變成了大多數(shù)發(fā)展史、分類(lèi)學(xué)和鑒定研究的標(biāo)準(zhǔn)方法。分子技術(shù)的發(fā)展大大加速了PCR的使用，反過(guò)來(lái)這也促進(jìn)了分子技術(shù)在研究環(huán)境樣品中的使用。一般的環(huán)境樣品，特別是土樣，由于存在大量的自然物質(zhì)（例如腐植酸、單寧和木質(zhì)素相關(guān)的化合物），會(huì)干擾PCR反應(yīng)和抑制擴(kuò)增。這些困難已經(jīng)被起始DNA提取方法的發(fā)展和優(yōu)化克服了。PCR最簡(jiǎn)單的經(jīng)驗(yàn)方法就是利用其反應(yīng)對(duì)低濃度DNA的超常敏感性來(lái)稀釋樣品到一定的濃度，此時(shí)抑制因素的濃度不再影響擴(kuò)增。但是如果起始樣本DNA本身就不高的話(huà)，這種方法就不太實(shí)用了。在這種情況下，起始的DNA提取往往要使用額外的試劑來(lái)去除抑制物。目前有許多這樣的方法，但是，大多數(shù)或者涉及包含和DNA選擇性結(jié)合的成分，例如十六烷基三甲基溴化銨，或者包含額外會(huì)排除特意性等級(jí)的抑制劑，例如去除多酚類(lèi)的聚乙稀聚吡咯烷酮PVPP。在極端情況下，可能必須使用兩種方法相結(jié)合的DNA提取步驟，或通過(guò)DNA親和柱來(lái)純化。真菌的分子學(xué)研究大部分集中于核糖體RNA基因簇上。但是真菌的機(jī)構(gòu)單元由三個(gè)核糖體RNA亞基，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和基因間隔區(qū)構(gòu)成。在真菌細(xì)胞核中有大量重復(fù)的基因簇，因此提供了很好的目標(biāo)區(qū)域。通常，亞基上的基因簇包含一些極度保守的序列，這些序列可以用來(lái)設(shè)計(jì)各種各樣的特異性PCR引物。這些特異性引物包括一些增強(qiáng)真菌特異性的或者特別是對(duì)于囊真菌或者擔(dān)子菌的。所以，使用這些引物可以從混有其他微生物DNA的樣本中把真菌序列給擴(kuò)增出來(lái)。這在研究地衣真菌研究領(lǐng)域被廣泛的采用，真菌DNA可以在含有污染海藻和細(xì)菌DNA的情況下被擴(kuò)增出來(lái)。這些引物使得真菌DNA從土壤DNA提取物中擴(kuò)增變得可能，然后通過(guò)DDGE、SSCP等技術(shù)產(chǎn)生種或者屬的圖譜。有大量的研究在真菌分類(lèi)時(shí)使用rRNA基因簇，大多數(shù)情況下，亞基因的保守序列可以用來(lái)研究分類(lèi)和親緣關(guān)系。多變間隔區(qū)也已經(jīng)被用來(lái)研究種內(nèi)和種間的關(guān)系?？墒牵覀兌贾酪粋€(gè)多變的關(guān)系和間隔區(qū)序列變化程度在不同的真菌之間變化很大。例如在內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的種內(nèi)變化在一些青霉屬種內(nèi)是1-2%，紋枯病菌內(nèi)則高于40%。但是，這些序列的差異并沒(méi)有阻止一系列PCR引物的發(fā)展，它們可以從特殊種和屬內(nèi)擴(kuò)增rDNA。這些引物被廣泛的應(yīng)用于土壤真菌和植物真菌菌根的研究。生態(tài)學(xué)研究分子技術(shù)應(yīng)用廣泛的一個(gè)土壤真菌學(xué)領(lǐng)域就是真菌生態(tài)學(xué)，特別是菌根真菌。PCR引物可以用來(lái)從菌根材料中擴(kuò)增真菌DNA，這種方法已被用來(lái)比較不同根部和土壤環(huán)境下的真菌多樣性。使用的方法包括總擴(kuò)增真菌ITS區(qū)域的酶切后獲得的多態(tài)性分析和種類(lèi)特異性引物的開(kāi)發(fā)。其中的一項(xiàng)基于ITS的RFLP技術(shù)的研究，比較了不同森林系統(tǒng)下的土壤真菌多樣性。在古老的和管理良好的森林之間，子實(shí)體的物種多樣性變化很大。但是，分子學(xué)方法顯示這兩種條件下檢測(cè)出的物種大量相似，導(dǎo)致人們認(rèn)為造林方法可能對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量的影響大于種群多樣性，盡管不清楚這種情況是否會(huì)持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間。其它的生態(tài)學(xué)研究觀察了土壤中子實(shí)體和物種多樣性的關(guān)系。有一項(xiàng)研究觀測(cè)了地上大量可見(jiàn)的物種豐富度，像子實(shí)體，和那些通過(guò)分子學(xué)方法檢測(cè)的地下的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一些物種（例如紅菇屬）只在地上子實(shí)體中出現(xiàn)時(shí)，其他的只在地下菌絲體中才能發(fā)現(xiàn)。所有的這些和相似的研究似乎說(shuō)明分子方法似乎不支持基本的調(diào)查和觀察結(jié)果。這在灌木菌根的研究中也得到了證實(shí)，其中圓葉風(fēng)鈴草共棲提供了一個(gè)例子。在這種情況下，土壤中兩種叢根菌根物種孢子的出現(xiàn)被作為風(fēng)鈴草潛在的內(nèi)生植物菌群。但是，相近的根部用分子學(xué)方法分析卻得到三個(gè)物種。在分析這種類(lèi)型的結(jié)果時(shí)要特別的小心。PCR的一個(gè)基本原理就是當(dāng)過(guò)量引物出現(xiàn)時(shí)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性雜交。在混合DNA物種的樣品中也可能發(fā)生相似的情況，因此PCR可能趨向于擴(kuò)增最優(yōu)勢(shì)微生物的DNA。單個(gè)真菌物種的豐富并不能指示真菌的生長(zhǎng)或活性，可能指示那些隱藏或者休眠的形式。目前大多數(shù)土壤真菌的分子研究工作是基于特殊類(lèi)群的序列特異性，因此不能排除更多物種的出現(xiàn)。在比較不同土壤環(huán)境樣品中真菌種群時(shí)分子學(xué)方法特別有用。其中一個(gè)例子就是McLean等進(jìn)行的有關(guān)歐石楠科和掌脈石楠科的杜鵑類(lèi)菌根的研究。它們使用ITS序列發(fā)現(xiàn)歐石楠科分離出的Hymenoscyp