乳酸桿菌對小鼠宮頸鱗癌u14的抗癌作用及細胞凋亡的誘導(dǎo)作用

乳酸桿菌對小鼠宮頸鱗癌u14的抗癌作用及細胞凋亡的誘導(dǎo)作用

宮頸是一種常見的婦科腫瘤，近年來其發(fā)病率有所增加。應(yīng)用微生物法治療腫瘤是新的研究熱點之一。乳酸桿菌(Lactobacillus,LB)作為新型生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,具有抗多種腫瘤作用,但對宮頸癌的抗癌作用未見報道。本動物實驗研究為將小鼠宮頸鱗癌U14移植于KM、615近交系鼠建立動物模型,以研究嗜酸乳桿菌(L.acidophilus,LA)、干酪乳桿菌(L.casie,LC)對U14移植瘤的抗癌作用,并從誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡角度,初步探討其抗癌機制,為應(yīng)用生理性細菌——LB輔助治療宮頸癌提供科學(xué)依據(jù)。移植瘤模型的建立瘤源:小鼠子宮頸鱗癌U14瘤細胞株,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供,經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇后,接種于615近交系小鼠腹腔傳代。當小鼠腹水呈乳白色時,采集腹水并用PBS緩沖液稀釋成5×107/ml瘤細胞懸液備用。菌種:LA標準菌株AS1.1878,LC標準菌株AS1.29,均由中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供,在微需氧環(huán)境中復(fù)蘇培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基,以PBS稀釋至5×1010/ml細菌懸液備用。實驗動物:健康清潔級KM雌性小鼠44只,5～6周齡,體重25±2g,合格證號魯動質(zhì)字D20020921,由山東魯抗醫(yī)藥集團動物中心提供;健康清潔級615近交系雌性小鼠24只,4～5周齡,體重20±2g,合格證號SCXK11-00-0005,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。抗癌對照藥物:DDP(Diaminodichloroplatin)注射針劑20mg/安瓿,山東齊魯制藥廠生產(chǎn),批號0208013。KM小鼠移植瘤模型建立與分組:34只KM小鼠均于右側(cè)背部皮下注射瘤細胞107個/只(0.2ml),隨機分為4組,種瘤24h后腹腔注射,模型組注射PBS液0.2ml;LA組注射LA1010/只(0.2ml);LC組注射LC1010/只(0.2ml),均連續(xù)10d;DDP組(陽性對照組)注射DDP0.2mg/只(0.2ml)(即按DDP10mg/kg鼠體重,經(jīng)折算相當人體用DDP量50mg/m2體表面積),為腹腔一次性注射后9d腹腔注射PBS液0.2ml。提前給予LA組的建立:10只KM鼠于第1天腹腔注射LA菌1010/只(0.2ml),連續(xù)5d,第6天建模型,24h后仍腹腔注射LA懸液(注射劑量、部位同前)10d。615小鼠移植瘤模型建立與分組:24只615小鼠建模后(注射劑量、部位同前),分3組(模型組、LA組、DDP組),余同KM鼠。取瘤與制備切片:所有小鼠停藥(菌)2d后,頸椎脫臼處死,取瘤塊,稱重,常規(guī)10%中性福爾馬林液固定,石蠟包埋,連續(xù)切片(約4μm厚),隨機選1張HE染色,組織學(xué)確定為子宮頸未分化鱗癌,其它切片用于原位細胞凋亡檢測。原位細胞凋亡檢測:采用TdT(脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法——TUNEL法(試劑為美國CHEMICON公司產(chǎn)品)。組織切片常規(guī)脫蠟至水,0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性,0.1mg/ml蛋白酶K消化40min,TdT反應(yīng)液、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(SP-HRP)37℃各作用1h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明、封片。實驗設(shè)加DNaseⅠ的為陽性對照,加不含TdT反應(yīng)液的為陰性對照。普通光學(xué)顯微鏡隨機選5個高倍視野(×400),記數(shù)其中凋亡細胞數(shù),并算出凋亡細胞占腫瘤細胞總數(shù)的百分比值,即凋亡指數(shù)AI(apoptosisindex)。統(tǒng)計學(xué)方法:SAS6.12統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析和組間s檢驗,兩組間比較用t檢驗,P<0.05、P<0.01分別作為差異有顯著性和極有顯著性的標準。結(jié)果1.大鼠移植瘤模型中的腫瘤狀況和動物死亡率各組小鼠皮下移植瘤細胞后,第5～7天出瘤,成瘤率100%。KM、615系鼠各死亡1只,均在DDP組。2.la對兩種類型的老鼠移植瘤都有顯著的抑瘤作用結(jié)果見表1。抑瘤率=(1-實驗組平均瘤重÷對照組平均瘤重)×100%。3.首先，生殖器瘤的生長速度明顯延遲。對照組結(jié)果見表2。4.la和lc對大鼠u14有顯著的抗癌作用，la和lc之間沒有顯著的抗癌作用結(jié)果見表3。5.非凋亡細胞的細胞光鏡下見,凋亡細胞明顯固縮,核致密,深染為棕黃色多葉狀或新月狀顆粒,常集聚在核周邊;非凋亡細胞的核呈藍色(圖1～3)。AI在615系模型組、LA、DDP組間的差異有極顯著性(P<0.01,表4)。b對妊娠和肺癌作用的機制研究小鼠子宮頸鱗癌U14是應(yīng)用專用線結(jié)經(jīng)甲基膽蒽浸泡后,穿進幼鼠宮頸誘發(fā)成瘤后,移植于遠交系KM小鼠皮下形成的一個異位子宮頸癌,能在小鼠(KM小鼠、615近交系小鼠)皮下形成可移植性實體瘤(成瘤率達100%),還可在腹腔內(nèi)形成腹水瘤,有血道、淋巴道雙向轉(zhuǎn)移特性,因此建立U14動物模型是研究宮頸癌的理想模型。本實驗中,KM小鼠及615近交系小鼠皮下移植U14瘤株后,其出瘤時間及瘤體生長情況與薛克勛等報道相似,移植瘤模型組瘤體平均重量大于1g,實驗組瘤體平均重量大于400mg,說明U14移植腫瘤生長良好,本實驗所建動物模型符合實驗要求。乳酸桿菌(LB)作為生理性細菌,其抗癌作用及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)活性已倍受關(guān)注。研究證實,LB可明顯抑制結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌及惡性黑色素瘤等多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),LB可通過激活機體免疫系統(tǒng),特別是巨噬細胞、NK細胞和B淋巴細胞,并使其分泌TNF-α、NO(nitricoxide)、INF-γ等效應(yīng)因子而發(fā)揮抗癌作用。近期文獻報道,LB的DNA含有大量非甲基化CpG二核苷酸為核心的重復(fù)序列,稱為CpG基元(CpGmotif),具有較強的免疫調(diào)節(jié)活性。生殖道正常菌群中的LB主要是嗜酸乳桿菌(LA)等,由于陰道內(nèi)LA數(shù)量的減少而造成的陰道菌群失調(diào)與細菌性陰道病、宮頸上皮瘤樣病變(CIN)等癌前病變有關(guān),推測LA與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,而LA對宮頸癌抗癌作用的相關(guān)研究尚未見報道,因此,研究LA對宮頸癌的抗癌作用及其機制具有重要臨床應(yīng)用價值。在抗癌實驗中,對實體瘤抑瘤率>30%～40%(統(tǒng)計學(xué)處理差異有顯著性)為抗癌有效指標。本實驗結(jié)果顯示,LA對兩種品系小鼠U14移植瘤的抑瘤率均超過40%,且提前給予LA的小鼠移植瘤生長速度顯著慢于對照組,提示LA抗宮頸癌作用具有廣泛性和有效性,并對于早期宮頸癌的發(fā)生或復(fù)發(fā)有一定抑制作用。實驗同時研究了LC對宮頸癌的抗癌作用,其抑瘤率為50.68%。TUNEL法可原位檢測凋亡細胞。細胞凋亡時,DNA會出現(xiàn)不對稱的斷裂點而形成缺口,末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)可將標記的dUTP結(jié)合在DNA缺口末端的3′-OH上,通過標記物顯色系統(tǒng)在組織細胞原位檢測凋亡細胞,并可在顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞,較適于研究體內(nèi)組織細胞凋亡,常應(yīng)用于石蠟組織切片的細胞凋亡檢測及定量研究,是檢測細胞凋亡敏感性和特異性較高的實驗。本實驗結(jié)果LA實驗組的AI為11.25%±4.06%,與模型組及陽性對照DDP組的差異有顯著性,表明LA的抗癌機制中包括誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,認為LA誘導(dǎo)巨噬細胞和NK細胞產(chǎn)生