低溫黑暗下擬南芥種子萌發(fā)的自然變異

低溫黑暗下擬南芥種子萌發(fā)的自然變異

低溫發(fā)芽是一個非常重要的農(nóng)業(yè)性能。提高種子發(fā)芽的耐寒性和低溫發(fā)芽能力可以使農(nóng)作物幼苗提早生長,這有利于幼苗與雜草競爭光和養(yǎng)分。對于在冬春直接播種的農(nóng)作物,對6℃低溫敏感不僅嚴重影響出苗率,也影響了作物的整齊度和一致性,降低產(chǎn)量。提高作物的耐寒性并確定控制低溫發(fā)芽的基因是一個全球性的重大研究課題。據(jù)報道,環(huán)境是打破種子休眠和發(fā)芽機制的綜合因素,其中光照和溫度是兩個制約種子發(fā)芽的主要因素。光照對種子發(fā)芽的影響主要是由光敏色素的感光器來實現(xiàn)的,光敏色素脫輔基蛋白PhyA、PhyB和PhyE已被證明可刺激發(fā)芽,種子在黑暗中發(fā)芽主要是通過PhyB實現(xiàn)的。一些植物激素起到內(nèi)部調(diào)節(jié)種子發(fā)芽或保持休眠的作用,例如赤霉素、乙烯、蕓苔素類固醇促進發(fā)芽,而脫落酸抑制發(fā)芽。一些研究也表明,光參與調(diào)節(jié)了一些基因包括通過光敏色素調(diào)節(jié)赤霉素和脫落酸的代謝。此外已經(jīng)證明,通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因GA3ox,光加速了赤霉素的生物合成。種子低溫下發(fā)芽可能會導致冷害,阻止幼苗發(fā)育,但擬南芥種子在吸脹期間短期冷處理可刺激發(fā)芽。雖然發(fā)芽中對低溫的反應機制還沒有完全被人們了解,但在低溫條件下發(fā)芽能力極有可能與冷適應機制有關。冷適應機制普遍與基因表達水平有關;受冷誘導的C-重復結(jié)合因子基因CBF1、CBF2和CBF3已被證明是關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。CBF1～3的表達是由PhyB調(diào)控的,而CBF對冷感應的轉(zhuǎn)錄水平在完全黑暗中降低了。最近的一項研究表明,光敏色素活性直接受溫度影響,因此,可能在發(fā)芽調(diào)控機制中有溫度和光兩個信號參與。鑒定那些感應光照和溫度、影響種子發(fā)芽的基因很重要,了解這些基因位點有助于選擇耐低溫發(fā)芽的作物品種。種子低溫發(fā)芽是個復雜的數(shù)量性狀,適宜用QTLs(QuantitativeTraitLoci)分析。有報道稱在水稻和番茄中檢測到低溫發(fā)芽QTL3個,但利用QTL方法研究擬南芥低溫黑暗發(fā)芽的報道極少,擬南芥和這些作物在低溫發(fā)芽中是否存在共同機制值得深入研究。本研究將利用兩個擬南芥生態(tài)型Bay-0和Shahdara雜交產(chǎn)生的重組近交系(RecombinantInbredLine,簡稱RIL)進行QTL分析,確定其主效基因,利用來自異源近親代(HeterogeneousInbredFamilies,簡稱HIF)的同源基因近親系(Near-isogeniclines,簡稱NIL),從遺傳學和生理學上驗證這些基因。1材料和方法1.1材料的播種來源不同生態(tài)型的種子來自法國凡爾賽生物資源中心(http://dbsgap.versailles.inra.fr/vnat/)。同時在溫室(18～28℃)營養(yǎng)缽里播種這些材料,最低光周期13h。重組近交系(RIL)來自Bay-0和shahdara雜交后代F7種子。異緣近親系(HIF)來自重組近交系F7的單株留種。播種每個重組近交系(例如RIL046),對應的基因型分別注明。每個基因型固定選擇2～3個單株并自交單獨留種。1.2測試方法1.2.1材料發(fā)芽率測定試驗設6℃低溫下黑暗和光照兩個處理。將50～100粒種子進行表面消毒后播種在含0.5%(w/v)的瓊脂糖的培養(yǎng)皿里,一組播種后立即用鋁箔紙包裹避光并放置在一個避光的盒子里,置于6℃冰箱里;另一組播種后直接放置在6℃光照下(5mmol/m2·s)培養(yǎng)。第16天后,分別統(tǒng)計有胚根破口而出的種子的發(fā)芽率。417個重組近交系的表型(發(fā)芽率)統(tǒng)計在6周多內(nèi)進行5次重復試驗。在6℃黑暗中發(fā)芽率高于20%的材料均被重新測試。植株培養(yǎng)和采種。在含29mmol/L蔗糖的B5固體培養(yǎng)基上播種,在光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1周后移植到溫室生長,光周期是20℃16h光/18℃8h黑暗,相對濕度70%,光照250mmol/m2·s。種子成熟后單株分別采收種子。1.2.2統(tǒng)計學和統(tǒng)計分析利用重組近交系,用方差分析模型(ANOVA)確定具體的基因型和環(huán)境影響的因素,量化廣義遺傳性(遺傳方差/總表型變異)。發(fā)芽試驗進行3次重復。方差分析獲得了使用aov函數(shù)的S-PLUS3.4版本統(tǒng)計學數(shù)據(jù)包(StatisticalSciences,Seattle,Washington)。一套38個分子標記和遺傳圖譜已使用MAPMAKER3.0軟件獲得,詳細分子標記如Loudet等所述(網(wǎng)址:http://dbsgap.versailles.inra.fr/vnat/)。QTL分析使用Unix版的CAR-TOGRAPHER1.14軟件。標準的區(qū)間作圖法(IM)和復合區(qū)間作圖法(CIM)如Loudet等2結(jié)果與分析2.1種子發(fā)芽率測定通過對309份種子的發(fā)芽試驗,大多數(shù)種子在6℃低溫黑暗中并沒有明顯發(fā)芽;只有其中15份種子發(fā)芽率大于20%,這些種子都通過栽培后采收種子重新測試發(fā)芽率,有14份種子被證實在低溫黑暗中發(fā)芽率超過20%(表1)。在6℃低溫和黑暗下生態(tài)型Bay-0無法發(fā)芽,而來自不同種子庫的Shahdara生態(tài)型的不同單株后代表現(xiàn)不同,編號為236和271的種子在6℃黑暗中有不同的發(fā)芽率,其中236號始終顯示較高的發(fā)芽水平(表1、圖1a)。2.2種子發(fā)芽時期的影響對于其中的一個生態(tài)型Bay-0(Bayreuth,編號41),在6℃黑暗中培養(yǎng)16d仍不發(fā)芽,而Shahdara有極高的發(fā)芽率(圖1a)。在轉(zhuǎn)移到6℃黑暗環(huán)境之前,Bay-0種子在光照中保留不同時間(5min～1h)并不能顯著刺激其發(fā)芽(最高發(fā)芽率4%±2%)。不過,兩個生態(tài)型在6℃低溫光照下都能夠完全發(fā)芽,9d后發(fā)芽率均達100%,雖然Bay-0發(fā)芽率一直比Shahdara略為遲緩(圖1b)。新鮮的Shaldara種子多數(shù)在25℃黑暗中難以發(fā)芽(發(fā)芽率僅3%),而在6℃黑暗中發(fā)芽率極高(發(fā)芽率99%,圖1a)。因此,低溫處理可以打破種子休眠。種子在干燥中貯藏就失去了休眠——一個稱為后熟的過程;對兩種不同時期的種子進行了研究。對Bay-0而言,在25℃黑暗中新鮮的和后熟的種子都不能發(fā)芽;但對Shaldara而言,25℃黑暗中新鮮的種子也難以發(fā)芽,而后熟的種子則能夠發(fā)芽(發(fā)芽率54%,圖1a);而且后熟時期越長,發(fā)芽程度越高。為了確定Bay-0種子發(fā)芽時對光的需求是否與赤霉素的生物合成或在黑暗中感應的差異有關,研究了植物激素的影響。研究結(jié)果表明,在低溫黑暗中赤霉素刺激了Bay-0的發(fā)芽(圖2),也增加Shaldara的發(fā)芽能力。2.3數(shù)量性狀的cdg擴增和基因組化采用417份RIL的F7種子,分析它們在6℃低溫和黑暗中的發(fā)芽能力。有趣的是Shaldara種子在低溫黑暗中表現(xiàn)出高發(fā)芽率(表1,圖1a),而Bay-0的發(fā)芽卻保持不變,幾乎不發(fā)芽。表現(xiàn)型(發(fā)芽率)的L形分布顯示了傾向于Bay-0的表型,其中38%的種子在低溫黑暗中只有10%或以下的發(fā)芽率(圖3),RIL群體平均發(fā)芽率為35%。利用RIL的F6群體和38個標記繪制了遺傳圖譜,一系列標記在染色體中的分布見圖4。使用411個RIL群體,被稱為CDG(Cold-tolerantDarkGermination)的6個QTL被定位,它們的LOD值大于2.2(表2);總的來說,他們解釋了總體67%的表型變異,其中3個為主效QTL(大于17%的總變異),差異極顯著(LOD值高于20),這3個主要QTL是降低Bay-0發(fā)芽的原因。在6個QTL中有4個(CDG-1～4)被檢測,相當于解釋總數(shù)63%的變異(表2)。剩下的2個QTL(CDG-5和CDG-6)影響非常小。由于在1%誤差內(nèi)沒有檢測到顯著的相互作用,故而沒有一個明確的解釋為何在RIL群體中Bay-0未發(fā)芽(圖3)。然而,3個CDG位點相互作用的詳細分析確實顯示一個閾值效應可能會出現(xiàn);在Bay-0中,3個數(shù)量性狀基因CDG中2個等位基因已固定的遺傳背景下加入1個等位基因,這種影響微乎其微。這極有可能是1級相互作用(CDG1×CDG3)和2級相互作用(CDG1×CDG2×CDG3)接近于0.05閾值,而明顯高于0.01的原因。2.4異源近親代的熱重標記選擇重組自交系(RIL)F6,它們的雜合子靠近CDG-1、CDG-2和CDG-3,但在其余的基因組中固定為純合子。這相當于RIL046、128、194為CDG-1;RIL010、102、422為CDG-2;RIL090、156為CDG-3(圖5a-c)。正如Loudet等所描述的一樣,從這些RIL的F7以適當?shù)臉擞浽诟信d趣的區(qū)域標記基因;異源近親代HIF被固定為標記,這些標記或以Bay-0、或以Shaldara的等位基因來測試。通過從每個單株采集的種子(F8),這些同源基因近親系(NILs)隨后表現(xiàn)在低溫黑暗中發(fā)芽(圖5d-f)。在Bay-0和Shaldara等位基因之間,3個為CDG-1的異源近親代(HIF)全都顯示了在低溫黑暗中發(fā)芽水平的差異。不過只有HIF046展示了預期中較高的與Shaldara等位基因相應的發(fā)芽水平,與QTL分析結(jié)果相一致,這說明了Bay-0等位基因在這個點上發(fā)芽降低。因此該HIF046將是QTL精細定位的適當選擇。同樣地,CDG-2和CDG-3的QTL分別被HIF010、HIF422和HIF156證實。而且,通過QTL分析發(fā)現(xiàn),純合子Bay-0和Shaldara的4個HIF基因型的區(qū)別與預計每個點的等位基因影響相類似。3冷處理、充放電、單一等位基因的使用光照和溫度是兩個制約種子發(fā)芽的主要因素,但目前對這些環(huán)境因素如何綜合影響發(fā)芽的機制還不夠清楚。為確定在何種程度上擬南芥在低溫黑暗中發(fā)芽能力上存在多樣性,對來自12個不同地理位置的300多份擬南芥資源材料進行了研究。早先Schmuths等對73份種子在長日照下分別在10℃、18℃和26℃發(fā)芽的分析,表明了大部分擬南芥種子發(fā)芽的自然變異與溫度有關。相反,本研究只有少數(shù)種子在6℃有明顯發(fā)芽,只有14份種子的發(fā)芽率大于20%。在Schmuths等的發(fā)芽試驗中,最低試驗溫度是10℃,因而本研究觀察到的相對有限的發(fā)芽差異反映了低溫對發(fā)芽的強烈限制作用。盡管如此,Bay-0種子在6℃低溫黑暗中沒有出現(xiàn)發(fā)芽,卻在6℃光照下出現(xiàn)了高水平的發(fā)芽;相反在25℃黑暗中沒有出現(xiàn)發(fā)芽。因此,大多數(shù)種子沒有發(fā)芽極可能反映了擬南芥發(fā)芽對強光的要求。眾所周知在種子吸脹時低溫會解除種子休眠,冷處理一個可能的作用是通過消除休眠而刺激Shahdara發(fā)芽。實際上,新鮮Shahdara種子在黑暗中25℃仍沒有發(fā)芽現(xiàn)象,但在6℃時卻有始終如一的高發(fā)芽率(圖1a)。相應的,后熟的Shahdara種子在25℃顯示更高水平的發(fā)芽,而且隨著后熟期而增加。冷處理可以調(diào)節(jié)Shahdara的脫落酸和赤霉素之間的平衡,因而使沒有光刺激下發(fā)芽成為可能,這也暗示對光的要求的改變。此外,使用赤霉素能刺激Bay-0和Shahdara在黑暗中發(fā)芽,赤霉素是一個影響種子黑暗中發(fā)芽的因素。為了確定一些擬南芥在低溫黑暗中發(fā)芽能力的基因特性,本研究分析了Bay-0和Shadara雜交產(chǎn)生的重組近交系(RIL)群體。這些數(shù)據(jù)顯示了在低溫黑暗中種子發(fā)芽能力有顯著差異:Bay-0無法發(fā)芽,而Shadara具有28%～100%的發(fā)芽率。這很清楚地從遺傳學上解釋了6個QTLCDG-1～6圖譜中大多數(shù)呈負等位基因的影響;相對于Bay-0等位基因,Shadara等位基因提高了發(fā)芽能力,這導致了復雜的遺傳背景,在父母本之間可能出現(xiàn)一個簡單性狀變異。本試驗構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜標記數(shù)量偏少,但因本試驗在法國進行,群體未帶回,無法加密。如果使用大量的重組近交系群體,額外的也可能被發(fā)現(xiàn)。RIL種子的發(fā)芽與不發(fā)芽表明了明顯的多樣性,正如所表現(xiàn)出來的L形頻率分布情況。在性狀變異范圍較低時發(fā)現(xiàn)的大量個體顯示了主要QTL之間的上位性作用;不過,通過從WebQTL程序配對掃描功能的重組近交系分析并未發(fā)現(xiàn)有任何顯著的上位性作用。另一個對這種表型分配的解釋是,測量的發(fā)芽百分率多變性,與個體數(shù)量性狀基因的作用不成線性關系,而且表現(xiàn)出閾值效應,使該0～10%的表型實際上綜合了不同的基因型個體。這也可能伴隨著母本基因組的相互作用,它們可參與性狀相關的種子發(fā)芽。該重組近交系產(chǎn)生于由Bay-0作為母本的植株雜交,因此都具有Bay-0的細胞質(zhì)。這也可以解釋為何只有一小部分具有3個主效基因的Shadara等位基因的重組近交系接近該Shadara表型。本研究觀察到,Shadara在黑暗中發(fā)芽需要冷處理或后熟,以及Bay-0在低溫和黑暗中處于休眠,光照對發(fā)芽是必需的。因此,鑒定CDG基因位點涉及到休眠機制和對應前面在分析休眠和發(fā)芽中確定的QTL?？刂坪诎抵邪l(fā)芽的1個QTL已經(jīng)在較早前被確定在擬南芥的2號染色體上,這是在規(guī)模較小的且在光照中發(fā)芽的QTL定位。這個QTL位于39和59cM之間,因此,不可能與CDG-2相對應。盡管如此,CDG-1也被定位在與擬南芥延遲發(fā)芽位點DOG-2和DOG-3相同的基因組區(qū)域,以及控制發(fā)芽速度的QTL基因組區(qū)域。以前從來沒有將影響發(fā)芽特性的基因位點分派到相應的CDG-2或CDG-3區(qū)域。此外,低溫發(fā)芽在以前是水稻和番茄的QTL研究主題,5個QTL中3個已經(jīng)被分別確定。本研究對擬南芥和這些物種在低溫發(fā)芽中是否存在共同機制的研究很有意義。本研究對來自12個不同地理位置的超過300份的擬南芥材料進行分析,已明確其中的14份材料在6℃低溫和黑暗中的發(fā)芽率超過20%,其中生態(tài)型Bay-0無法發(fā)芽,而Shadara具有較高的發(fā)芽率。這種自然變異被利用