低溫黑暗下擬南芥種子萌發(fā)的自然變異

低溫黑暗下擬南芥種子萌發(fā)的自然變異

低溫發(fā)芽是一個(gè)非常重要的農(nóng)業(yè)性能。提高種子發(fā)芽的耐寒性和低溫發(fā)芽能力可以使農(nóng)作物幼苗提早生長,這有利于幼苗與雜草競爭光和養(yǎng)分。對(duì)于在冬春直接播種的農(nóng)作物,對(duì)6℃低溫敏感不僅嚴(yán)重影響出苗率,也影響了作物的整齊度和一致性,降低產(chǎn)量。提高作物的耐寒性并確定控制低溫發(fā)芽的基因是一個(gè)全球性的重大研究課題。據(jù)報(bào)道,環(huán)境是打破種子休眠和發(fā)芽機(jī)制的綜合因素,其中光照和溫度是兩個(gè)制約種子發(fā)芽的主要因素。光照對(duì)種子發(fā)芽的影響主要是由光敏色素的感光器來實(shí)現(xiàn)的,光敏色素脫輔基蛋白PhyA、PhyB和PhyE已被證明可刺激發(fā)芽,種子在黑暗中發(fā)芽主要是通過PhyB實(shí)現(xiàn)的。一些植物激素起到內(nèi)部調(diào)節(jié)種子發(fā)芽或保持休眠的作用,例如赤霉素、乙烯、蕓苔素類固醇促進(jìn)發(fā)芽,而脫落酸抑制發(fā)芽。一些研究也表明,光參與調(diào)節(jié)了一些基因包括通過光敏色素調(diào)節(jié)赤霉素和脫落酸的代謝。此外已經(jīng)證明,通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因GA3ox,光加速了赤霉素的生物合成。種子低溫下發(fā)芽可能會(huì)導(dǎo)致冷害,阻止幼苗發(fā)育,但擬南芥種子在吸脹期間短期冷處理可刺激發(fā)芽。雖然發(fā)芽中對(duì)低溫的反應(yīng)機(jī)制還沒有完全被人們了解,但在低溫條件下發(fā)芽能力極有可能與冷適應(yīng)機(jī)制有關(guān)。冷適應(yīng)機(jī)制普遍與基因表達(dá)水平有關(guān);受冷誘導(dǎo)的C-重復(fù)結(jié)合因子基因CBF1、CBF2和CBF3已被證明是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。CBF1～3的表達(dá)是由PhyB調(diào)控的,而CBF對(duì)冷感應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平在完全黑暗中降低了。最近的一項(xiàng)研究表明,光敏色素活性直接受溫度影響,因此,可能在發(fā)芽調(diào)控機(jī)制中有溫度和光兩個(gè)信號(hào)參與。鑒定那些感應(yīng)光照和溫度、影響種子發(fā)芽的基因很重要,了解這些基因位點(diǎn)有助于選擇耐低溫發(fā)芽的作物品種。種子低溫發(fā)芽是個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀,適宜用QTLs(QuantitativeTraitLoci)分析。有報(bào)道稱在水稻和番茄中檢測(cè)到低溫發(fā)芽QTL3個(gè),但利用QTL方法研究擬南芥低溫黑暗發(fā)芽的報(bào)道極少,擬南芥和這些作物在低溫發(fā)芽中是否存在共同機(jī)制值得深入研究。本研究將利用兩個(gè)擬南芥生態(tài)型Bay-0和Shahdara雜交產(chǎn)生的重組近交系(RecombinantInbredLine,簡稱RIL)進(jìn)行QTL分析,確定其主效基因,利用來自異源近親代(HeterogeneousInbredFamilies,簡稱HIF)的同源基因近親系(Near-isogeniclines,簡稱NIL),從遺傳學(xué)和生理學(xué)上驗(yàn)證這些基因。1材料和方法1.1材料的播種來源不同生態(tài)型的種子來自法國凡爾賽生物資源中心(http://dbsgap.versailles.inra.fr/vnat/)。同時(shí)在溫室(18～28℃)營養(yǎng)缽里播種這些材料,最低光周期13h。重組近交系(RIL)來自Bay-0和shahdara雜交后代F7種子。異緣近親系(HIF)來自重組近交系F7的單株留種。播種每個(gè)重組近交系(例如RIL046),對(duì)應(yīng)的基因型分別注明。每個(gè)基因型固定選擇2～3個(gè)單株并自交單獨(dú)留種。1.2測(cè)試方法1.2.1材料發(fā)芽率測(cè)定試驗(yàn)設(shè)6℃低溫下黑暗和光照兩個(gè)處理。將50～100粒種子進(jìn)行表面消毒后播種在含0.5%(w/v)的瓊脂糖的培養(yǎng)皿里,一組播種后立即用鋁箔紙包裹避光并放置在一個(gè)避光的盒子里,置于6℃冰箱里;另一組播種后直接放置在6℃光照下(5mmol/m2·s)培養(yǎng)。第16天后,分別統(tǒng)計(jì)有胚根破口而出的種子的發(fā)芽率。417個(gè)重組近交系的表型(發(fā)芽率)統(tǒng)計(jì)在6周多內(nèi)進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)。在6℃黑暗中發(fā)芽率高于20%的材料均被重新測(cè)試。植株培養(yǎng)和采種。在含29mmol/L蔗糖的B5固體培養(yǎng)基上播種,在光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1周后移植到溫室生長,光周期是20℃16h光/18℃8h黑暗,相對(duì)濕度70%,光照250mmol/m2·s。種子成熟后單株分別采收種子。1.2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析利用重組近交系,用方差分析模型(ANOVA)確定具體的基因型和環(huán)境影響的因素,量化廣義遺傳性(遺傳方差/總表型變異)。發(fā)芽試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。方差分析獲得了使用aov函數(shù)的S-PLUS3.4版本統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)包(StatisticalSciences,Seattle,Washington)。一套38個(gè)分子標(biāo)記和遺傳圖譜已使用MAPMAKER3.0軟件獲得,詳細(xì)分子標(biāo)記如Loudet等所述(網(wǎng)址:http://dbsgap.versailles.inra.fr/vnat/)。QTL分析使用Unix版的CAR-TOGRAPHER1.14軟件。標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)間作圖法(IM)和復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)如Loudet等2結(jié)果與分析2.1種子發(fā)芽率測(cè)定通過對(duì)309份種子的發(fā)芽試驗(yàn),大多數(shù)種子在6℃低溫黑暗中并沒有明顯發(fā)芽;只有其中15份種子發(fā)芽率大于20%,這些種子都通過栽培后采收種子重新測(cè)試發(fā)芽率,有14份種子被證實(shí)在低溫黑暗中發(fā)芽率超過20%(表1)。在6℃低溫和黑暗下生態(tài)型Bay-0無法發(fā)芽,而來自不同種子庫的Shahdara生態(tài)型的不同單株后代表現(xiàn)不同,編號(hào)為236和271的種子在6℃黑暗中有不同的發(fā)芽率,其中236號(hào)始終顯示較高的發(fā)芽水平(表1、圖1a)。2.2種子發(fā)芽時(shí)期的影響對(duì)于其中的一個(gè)生態(tài)型Bay-0(Bayreuth,編號(hào)41),在6℃黑暗中培養(yǎng)16d仍不發(fā)芽,而Shahdara有極高的發(fā)芽率(圖1a)。在轉(zhuǎn)移到6℃黑暗環(huán)境之前,Bay-0種子在光照中保留不同時(shí)間(5min～1h)并不能顯著刺激其發(fā)芽(最高發(fā)芽率4%±2%)。不過,兩個(gè)生態(tài)型在6℃低溫光照下都能夠完全發(fā)芽,9d后發(fā)芽率均達(dá)100%,雖然Bay-0發(fā)芽率一直比Shahdara略為遲緩(圖1b)。新鮮的Shaldara種子多數(shù)在25℃黑暗中難以發(fā)芽(發(fā)芽率僅3%),而在6℃黑暗中發(fā)芽率極高(發(fā)芽率99%,圖1a)。因此,低溫處理可以打破種子休眠。種子在干燥中貯藏就失去了休眠——一個(gè)稱為后熟的過程;對(duì)兩種不同時(shí)期的種子進(jìn)行了研究。對(duì)Bay-0而言,在25℃黑暗中新鮮的和后熟的種子都不能發(fā)芽;但對(duì)Shaldara而言,25℃黑暗中新鮮的種子也難以發(fā)芽,而后熟的種子則能夠發(fā)芽(發(fā)芽率54%,圖1a);而且后熟時(shí)期越長,發(fā)芽程度越高。為了確定Bay-0種子發(fā)芽時(shí)對(duì)光的需求是否與赤霉素的生物合成或在黑暗中感應(yīng)的差異有關(guān),研究了植物激素的影響。研究結(jié)果表明,在低溫黑暗中赤霉素刺激了Bay-0的發(fā)芽(圖2),也增加Shaldara的發(fā)芽能力。2.3數(shù)量性狀的cdg擴(kuò)增和基因組化采用417份RIL的F7種子,分析它們?cè)?℃低溫和黑暗中的發(fā)芽能力。有趣的是Shaldara種子在低溫黑暗中表現(xiàn)出高發(fā)芽率(表1,圖1a),而Bay-0的發(fā)芽卻保持不變,幾乎不發(fā)芽。表現(xiàn)型(發(fā)芽率)的L形分布顯示了傾向于Bay-0的表型,其中38%的種子在低溫黑暗中只有10%或以下的發(fā)芽率(圖3),RIL群體平均發(fā)芽率為35%。利用RIL的F6群體和38個(gè)標(biāo)記繪制了遺傳圖譜,一系列標(biāo)記在染色體中的分布見圖4。使用411個(gè)RIL群體,被稱為CDG(Cold-tolerantDarkGermination)的6個(gè)QTL被定位,它們的LOD值大于2.2(表2);總的來說,他們解釋了總體67%的表型變異,其中3個(gè)為主效QTL(大于17%的總變異),差異極顯著(LOD值高于20),這3個(gè)主要QTL是降低Bay-0發(fā)芽的原因。在6個(gè)QTL中有4個(gè)(CDG-1～4)被檢測(cè),相當(dāng)于解釋總數(shù)63%的變異(表2)。剩下的2個(gè)QTL(CDG-5和CDG-6)影響非常小。由于在1%誤差內(nèi)沒有檢測(cè)到顯著的相互作用,故而沒有一個(gè)明確的解釋為何在RIL群體中Bay-0未發(fā)芽(圖3)。然而,3個(gè)CDG位點(diǎn)相互作用的詳細(xì)分析確實(shí)顯示一個(gè)閾值效應(yīng)可能會(huì)出現(xiàn);在Bay-0中,3個(gè)數(shù)量性狀基因CDG中2個(gè)等位基因已固定的遺傳背景下加入1個(gè)等位基因,這種影響微乎其微。這極有可能是1級(jí)相互作用(CDG1×CDG3)和2級(jí)相互作用(CDG1×CDG2×CDG3)接近于0.05閾值,而明顯高于0.01的原因。2.4異源近親代的熱重標(biāo)記選擇重組自交系(RIL)F6,它們的雜合子靠近CDG-1、CDG-2和CDG-3,但在其余的基因組中固定為純合子。這相當(dāng)于RIL046、128、194為CDG-1;RIL010、102、422為CDG-2;RIL090、156為CDG-3(圖5a-c)。正如Loudet等所描述的一樣,從這些RIL的F7以適當(dāng)?shù)臉?biāo)記在感興趣的區(qū)域標(biāo)記基因;異源近親代HIF被固定為標(biāo)記,這些標(biāo)記或以Bay-0、或以Shaldara的等位基因來測(cè)試。通過從每個(gè)單株采集的種子(F8),這些同源基因近親系(NILs)隨后表現(xiàn)在低溫黑暗中發(fā)芽(圖5d-f)。在Bay-0和Shaldara等位基因之間,3個(gè)為CDG-1的異源近親代(HIF)全都顯示了在低溫黑暗中發(fā)芽水平的差異。不過只有HIF046展示了預(yù)期中較高的與Shaldara等位基因相應(yīng)的發(fā)芽水平,與QTL分析結(jié)果相一致,這說明了Bay-0等位基因在這個(gè)點(diǎn)上發(fā)芽降低。因此該HIF046將是QTL精細(xì)定位的適當(dāng)選擇。同樣地,CDG-2和CDG-3的QTL分別被HIF010、HIF422和HIF156證實(shí)。而且,通過QTL分析發(fā)現(xiàn),純合子Bay-0和Shaldara的4個(gè)HIF基因型的區(qū)別與預(yù)計(jì)每個(gè)點(diǎn)的等位基因影響相類似。3冷處理、充放電、單一等位基因的使用光照和溫度是兩個(gè)制約種子發(fā)芽的主要因素,但目前對(duì)這些環(huán)境因素如何綜合影響發(fā)芽的機(jī)制還不夠清楚。為確定在何種程度上擬南芥在低溫黑暗中發(fā)芽能力上存在多樣性,對(duì)來自12個(gè)不同地理位置的300多份擬南芥資源材料進(jìn)行了研究。早先Schmuths等對(duì)73份種子在長日照下分別在10℃、18℃和26℃發(fā)芽的分析,表明了大部分?jǐn)M南芥種子發(fā)芽的自然變異與溫度有關(guān)。相反,本研究只有少數(shù)種子在6℃有明顯發(fā)芽,只有14份種子的發(fā)芽率大于20%。在Schmuths等的發(fā)芽試驗(yàn)中,最低試驗(yàn)溫度是10℃,因而本研究觀察到的相對(duì)有限的發(fā)芽差異反映了低溫對(duì)發(fā)芽的強(qiáng)烈限制作用。盡管如此,Bay-0種子在6℃低溫黑暗中沒有出現(xiàn)發(fā)芽,卻在6℃光照下出現(xiàn)了高水平的發(fā)芽;相反在25℃黑暗中沒有出現(xiàn)發(fā)芽。因此,大多數(shù)種子沒有發(fā)芽極可能反映了擬南芥發(fā)芽對(duì)強(qiáng)光的要求。眾所周知在種子吸脹時(shí)低溫會(huì)解除種子休眠,冷處理一個(gè)可能的作用是通過消除休眠而刺激Shahdara發(fā)芽。實(shí)際上,新鮮Shahdara種子在黑暗中25℃仍沒有發(fā)芽現(xiàn)象,但在6℃時(shí)卻有始終如一的高發(fā)芽率(圖1a)。相應(yīng)的,后熟的Shahdara種子在25℃顯示更高水平的發(fā)芽,而且隨著后熟期而增加。冷處理可以調(diào)節(jié)Shahdara的脫落酸和赤霉素之間的平衡,因而使沒有光刺激下發(fā)芽成為可能,這也暗示對(duì)光的要求的改變。此外,使用赤霉素能刺激Bay-0和Shahdara在黑暗中發(fā)芽,赤霉素是一個(gè)影響種子黑暗中發(fā)芽的因素。為了確定一些擬南芥在低溫黑暗中發(fā)芽能力的基因特性,本研究分析了Bay-0和Shadara雜交產(chǎn)生的重組近交系(RIL)群體。這些數(shù)據(jù)顯示了在低溫黑暗中種子發(fā)芽能力有顯著差異:Bay-0無法發(fā)芽,而Shadara具有28%～100%的發(fā)芽率。這很清楚地從遺傳學(xué)上解釋了6個(gè)QTLCDG-1～6圖譜中大多數(shù)呈負(fù)等位基因的影響;相對(duì)于Bay-0等位基因,Shadara等位基因提高了發(fā)芽能力,這導(dǎo)致了復(fù)雜的遺傳背景,在父母本之間可能出現(xiàn)一個(gè)簡單性狀變異。本試驗(yàn)構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜標(biāo)記數(shù)量偏少,但因本試驗(yàn)在法國進(jìn)行,群體未帶回,無法加密。如果使用大量的重組近交系群體,額外的也可能被發(fā)現(xiàn)。RIL種子的發(fā)芽與不發(fā)芽表明了明顯的多樣性,正如所表現(xiàn)出來的L形頻率分布情況。在性狀變異范圍較低時(shí)發(fā)現(xiàn)的大量個(gè)體顯示了主要QTL之間的上位性作用;不過,通過從WebQTL程序配對(duì)掃描功能的重組近交系分析并未發(fā)現(xiàn)有任何顯著的上位性作用。另一個(gè)對(duì)這種表型分配的解釋是,測(cè)量的發(fā)芽百分率多變性,與個(gè)體數(shù)量性狀基因的作用不成線性關(guān)系,而且表現(xiàn)出閾值效應(yīng),使該0～10%的表型實(shí)際上綜合了不同的基因型個(gè)體。這也可能伴隨著母本基因組的相互作用,它們可參與性狀相關(guān)的種子發(fā)芽。該重組近交系產(chǎn)生于由Bay-0作為母本的植株雜交,因此都具有Bay-0的細(xì)胞質(zhì)。這也可以解釋為何只有一小部分具有3個(gè)主效基因的Shadara等位基因的重組近交系接近該Shadara表型。本研究觀察到,Shadara在黑暗中發(fā)芽需要冷處理或后熟,以及Bay-0在低溫和黑暗中處于休眠,光照對(duì)發(fā)芽是必需的。因此,鑒定CDG基因位點(diǎn)涉及到休眠機(jī)制和對(duì)應(yīng)前面在分析休眠和發(fā)芽中確定的QTL?？刂坪诎抵邪l(fā)芽的1個(gè)QTL已經(jīng)在較早前被確定在擬南芥的2號(hào)染色體上,這是在規(guī)模較小的且在光照中發(fā)芽的QTL定位。這個(gè)QTL位于39和59cM之間,因此,不可能與CDG-2相對(duì)應(yīng)。盡管如此,CDG-1也被定位在與擬南芥延遲發(fā)芽位點(diǎn)DOG-2和DOG-3相同的基因組區(qū)域,以及控制發(fā)芽速度的QTL基因組區(qū)域。以前從來沒有將影響發(fā)芽特性的基因位點(diǎn)分派到相應(yīng)的CDG-2或CDG-3區(qū)域。此外,低溫發(fā)芽在以前是水稻和番茄的QTL研究主題,5個(gè)QTL中3個(gè)已經(jīng)被分別確定。本研究對(duì)擬南芥和這些物種在低溫發(fā)芽中是否存在共同機(jī)制的研究很有意義。本研究對(duì)來自12個(gè)不同地理位置的超過300份的擬南芥材料進(jìn)行分析,已明確其中的14份材料在6℃低溫和黑暗中的發(fā)芽率超過20%,其中生態(tài)型Bay-0無法發(fā)芽,而Shadara具有較高的發(fā)芽率。這種自然變異被利用