第八章+植物細胞培養(yǎng)及此生物質(zhì)生產(chǎn)

第8章植物細胞培養(yǎng)及

次生物質(zhì)生產(chǎn)8.1植物單細胞培養(yǎng)8.2植物細胞懸浮培養(yǎng)8.3植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及次生物質(zhì)生產(chǎn)植物細胞培養(yǎng)是指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的單個細胞或小細胞團，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)可在培養(yǎng)瓶中進行。大規(guī)模的需要利用生物反應器生產(chǎn)。植物細胞培養(yǎng)是在植物組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)之上發(fā)展起來的。理論基礎(chǔ)是植物細胞的單個細胞內(nèi)存在生命體的全部能力（全能性）。8.1植物單細胞的培養(yǎng)8.1.1單細胞制備方法8.1.2單細胞培養(yǎng)技術(shù)8.1.1單細胞制備方法機械法：主要通過機械磨碎、切割植物體從而獲得游離的單體。如葉肉組織細胞的分離。由于愈傷組織細胞之間的結(jié)構(gòu)非常松散，因此可以通過高頻率振動從懸浮狀態(tài)的愈傷組織中振蕩下來單個細胞。方法原始、效率低，細胞易破，獲得細胞數(shù)量有限。但操作方便，且不會改變細胞的生理特性。化學方法草酸鹽，秋水仙素，CH，2，4-D等對分散細胞有一定作用。酶解法：目前最為有效的一種獲得單細胞的方法。還可根據(jù)植物細胞壁的組成特點選用專一性水解酶，在溫和條件下將壁物質(zhì)分解掉，從而釋放出細胞。該法主要用于制備原生質(zhì)體。果膠酶、纖維素酶等?；瘜W方法和酶法可獲得大量分散細胞，但易引起細胞生理改變。8.1.2單細胞培養(yǎng)技術(shù)8.1.2.1平板培養(yǎng)法是將懸浮培養(yǎng)的分散細胞均勻分布在一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。具體步驟：單細胞懸浮液的制備，并記數(shù)。調(diào)節(jié)細胞密度。1×103-1×105個/ml。培養(yǎng)基選擇與凝固劑選擇，30-35℃混勻澆平板。密封后在倒置顯微鏡下標記單細胞位置。25℃，暗培養(yǎng)。數(shù)天后計算植板率。平板培養(yǎng)注意事項：植板密度不能低于某一臨界值（臨界密度）；添加有機成分或采用條件培養(yǎng)基，植板密度可以低一些。應選用旺盛分裂期細胞；操作時減少細胞損傷；黑暗或弱光培養(yǎng)。1×103~1×105個/ml。臨界密度：單細胞培養(yǎng)時，初始植板密度低于某值，培養(yǎng)細胞就不能進行分裂和發(fā)育成細胞團，則該值就是臨界密度。初始植板密度應根據(jù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況而改變，培養(yǎng)基越復雜則植板細胞的臨界密度越低，反之則相反。8.1.2.2看護培養(yǎng)是指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續(xù)生長和增殖的一種培養(yǎng)方法。這塊愈傷組織被稱為看護組織。具體方法是將單個細胞接種于濾紙上，再置于愈傷組織之上培養(yǎng)。優(yōu)點是簡便、成功率高。8.1.2.3微室培養(yǎng)是為了進行單細胞活體連續(xù)觀察而建立的一種微量細胞培養(yǎng)技術(shù)。微室培養(yǎng)要求：微室要采用光學性能好的材料；材料能使小室與外界隔絕，且能保證適當?shù)臍怏w交換。合適的培養(yǎng)基。能保證細胞生長和分裂。選擇合適的細胞。處于旺盛分裂期細胞，壁薄，透明度高。主要指將植物細胞和小的細胞團懸浮于液體培養(yǎng)基中，在保持細胞良好分散狀態(tài)下進行培養(yǎng)的技術(shù)。

細胞懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點是：能大量提供分散性好且比較均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造條件。細胞營養(yǎng)吸收充分、環(huán)境條件好，細胞增殖快。可避免有害代謝物在局部濃度過高。適合大規(guī)模的培養(yǎng)，生產(chǎn)有價值的活性代謝物。8.2植物細胞的懸浮培養(yǎng)8.2.1細胞懸浮培養(yǎng)一般過程疏松易碎愈傷組織誘導：外植體，基本培養(yǎng)基及有機附加物（CH、谷氨酰胺等），植物生長物質(zhì)（2，4-D和細胞分裂素）的種類、濃度和比例等，蔗糖濃度（10-30g/L）等均對疏松愈傷組織的形成有影響。愈傷組織反復繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。這樣可獲得大量均勻一致，疏松易碎，適合建立懸浮細胞系的愈傷組織。單細胞分離及細胞懸浮培養(yǎng):選擇合適的接種密度（104-105個/mL）、溫度，搖床轉(zhuǎn)速等。愈傷組織形成和植株再生：懸浮細胞可直接形成肧狀體或經(jīng)愈傷組織分化成再生植株（快繁）。

如果以生產(chǎn)代謝產(chǎn)物為目的的細胞懸浮培養(yǎng)，則應采取適當措施分散開不斷聚集的細胞團，使細胞保持繼續(xù)增殖，達到最高細胞密度，收獲目的產(chǎn)物。8.2.2細胞懸浮培養(yǎng)工藝8.2.2.1分批培養(yǎng)指在培養(yǎng)過程中，一次性加入培養(yǎng)基，在一定條件下培養(yǎng)一段時間后，一次性收獲。即不向培養(yǎng)系統(tǒng)中補加培養(yǎng)基，也不從系統(tǒng)中排出培養(yǎng)物。細胞生長呈現(xiàn)“S”形生長曲線。懸浮細胞生長與增殖

延遲期，對數(shù)生長期、直線生長期、減緩期、靜止期、衰亡期。8.2.2.2連續(xù)培養(yǎng)

指在培養(yǎng)過程中，連續(xù)地以一定速度添加培養(yǎng)液，同時排出舊的培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物不斷得到營養(yǎng)物質(zhì)補充并保持培養(yǎng)液總體積不變的培養(yǎng)。封閉式連續(xù)培養(yǎng)：指新老培養(yǎng)液同時、等量流進、流出，回收細胞于培養(yǎng)系統(tǒng)中，細胞數(shù)目不斷增加。開放式連續(xù)培養(yǎng)：新鮮培養(yǎng)基的加入和等體積的細胞懸液的收獲是平衡的，不回收細胞于培養(yǎng)系統(tǒng)中，而是進行收獲，使培養(yǎng)細胞數(shù)目保持恒定，流出的細胞數(shù)相當于培養(yǎng)系統(tǒng)中新細胞的增加數(shù)。通過調(diào)節(jié)流入和流出的速度，培養(yǎng)物的生長速度永遠保持接近最高值的恒定水平上。半連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，每隔一定時間抽取出一定量的細胞懸液，同時加入等量的新鮮培養(yǎng)液。植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的意義：節(jié)約能源，減少耕地占用面積，而且不受季節(jié)、地域限制。有利于對生態(tài)環(huán)境和珍稀植物資源的保護。排除病菌和害蟲影響?？赏ㄟ^特定生物轉(zhuǎn)化途徑獲得均一的有效成分。利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥物和一些工業(yè)原料已成為工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)品的一條有效途徑。通過植物細胞培養(yǎng)可以生產(chǎn)相當于幾倍或幾十倍完整植株所產(chǎn)生的次生物質(zhì)。具有極大的經(jīng)濟效益。8.3植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和次生物質(zhì)生產(chǎn)植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應用：藥物代謝產(chǎn)物目前采用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物成分主要包括：苷類：皂苷、強心苷、甘草皂苷、香豆精苷等。淄醇：菜油、豆、谷、膽、異巖藻淄醇等。生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。醌類：恩醌、萘醌、返醌等。蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑、植物病毒抑制劑、植物抗生素等。紫杉醇、紫草寧、人參。

天然食品、食品添加劑色素：胡蘿卜素、葉黃素、單寧、黃酮體等。咖啡——可可堿、咖啡堿；海藻——瓊脂；甜菊葉——甜菊苷；辣椒——辣椒素。殺蟲劑、殺菌劑從萬壽菊——農(nóng)藥唾吩烷；從鷹嘴豆和掃帚艾——三種魚藤生物堿、灰葉素、魚藤酮以及除蟲菊脂等；從葫蘆巴（香草）——藍魚藤酮、粉紅魚藤酮等殺蟲劑；從錦葵葉——生物堿。飼料、精細化工等產(chǎn)品蠶飼料：桑、蓖麻、榆等。銀膠菌細胞愈傷組織中生產(chǎn)橡膠。植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)主要包括3個步驟：誘導植物產(chǎn)生旺盛生長的愈傷組織并建立懸浮細胞系篩選高產(chǎn)細胞系在生物反應器中大量培養(yǎng)細胞或細胞團并適時收獲。8.3.1細胞株的篩選生長活躍、合成目的產(chǎn)物較多部位取材----愈傷組織培養(yǎng)----液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)以分散細胞----用單細胞培養(yǎng)技術(shù)獲得單細胞克隆產(chǎn)生的愈傷組織----測定其次生代謝產(chǎn)物含量，選出高產(chǎn)細胞系----繼代多次，產(chǎn)物含量仍高，則為穩(wěn)定的高產(chǎn)細胞系----可用于大規(guī)模細胞培養(yǎng)。8.3.2培養(yǎng)基的選擇適合細胞生長的培養(yǎng)基不一定適合目的產(chǎn)物的生產(chǎn)，因此，采用兩步培養(yǎng)法。首先將細胞培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基上，促進細胞快速增殖，然后轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)培養(yǎng)基上促進細胞合成目的次生代謝產(chǎn)物。植物生長物質(zhì)：2，4-D、NAA、IAA、6-BA、KT等。前體：合成代謝物所必需的前體物質(zhì)。誘導子：能引起植物細胞某些代謝強度或代謝途徑發(fā)生改變的物質(zhì)。包括生物（微生物或其提取物等）和非生物（輻射、金屬離子等）兩類。8.3.3培養(yǎng)條件光：光照時間、光質(zhì)、光強均有影響。溫度：應根據(jù)不同細胞培養(yǎng)物及合成不同次生代謝物種類而定。PH：一般在5-6之間。8.3.4生物反應器的選擇適合植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應器應該具有合適的氧傳遞、良好的流動性和低的剪切力。生物反應器設(shè)計要總體上考慮以下幾個重要因素：1) 結(jié)構(gòu)嚴密，能耐受蒸汽滅菌，無害耐蝕材料，內(nèi)壁光滑。2) 有良好的氣－液接觸和液－固混和性能及熱量交換性能。3) 保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量下，盡量節(jié)省能源消耗。4) 減少泡沫的產(chǎn)生，有參數(shù)檢測和控制儀表，能聯(lián)機。三種應用于植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應器：機械攪拌式反應器氣動式生物反應器：鼓泡式、氣升式固定化細胞生物反應器8.3.4.1攪拌式反應器原理：利用機械攪動使細胞懸浮和通氣。優(yōu)點：攪拌充分，供氧和混合效果好。缺點：剪切力容易傷害植物細胞。機械攪拌式反應器示意圖8.3.4.2氣動式生物反應器原理：利用空氣動力使培養(yǎng)液流動。優(yōu)點：剪切力小，對細胞傷害小。易長時間無菌培養(yǎng)。缺點：低氣速細胞容易聚集，與培養(yǎng)液混合差。高氣速會產(chǎn)生泡沫，影響植物細胞生長。8.3.4.3固定化細胞生物反應系統(tǒng)細胞固定化是指將游離的細胞包埋在多糖或多聚化合物等中，或使其