氧化石墨烯的制備及其在生物傳感器中的應(yīng)用

氧化石墨烯的制備及其在生物傳感器中的應(yīng)用

石墨烯是一種碳原子緊密沉積在二維辦公廳結(jié)構(gòu)上的新材料（見圖1所示）。這種石墨晶體膜的厚度僅為0.34nm。它是設(shè)計其他碳材料（如零維碳、納米碳管、三維石墨等）的基本單元。它具有良好的結(jié)晶性、導(dǎo)電性、完美的鈉隧道效應(yīng)、半晶態(tài)耗旋效應(yīng)和不消失的電導(dǎo)率等性質(zhì)。石墨是一種疏水性物質(zhì),與其相比,氧化石墨具有大量的羥基、羧基等基團,是一種親水性物質(zhì)。其層間距也比石墨的層間距更大。因此,人們常將石墨氧化生成氧化石墨來制備石墨烯和氧化石墨烯納米材料,氧化石墨用肼還原后再剝離所形成的是石墨烯,而沒有用肼還原就直接剝離所形成的便是氧化石墨烯。二者的差異主要表現(xiàn)是氧化石墨烯表面均勻的分布著大量的-COOH和-OH,而石墨烯只在特定的地方分布有-COOH和-OH。氧化石墨常用的方法有:化學(xué)法、Standenmaier法、Brodie法、Hummers和Offeman法等。而氧化石墨經(jīng)過適當?shù)姆椒ㄈ鐧C械方法、熱膨脹剝離法和超聲波震動處理即可制得石墨烯。超聲法極易在有機溶劑或者水溶液中分散成為均勻的單層氧化石墨烯溶液,這為制備大量的單層石墨烯提供了可能性。結(jié)合碳材料、納米材料及碳納米層材料的優(yōu)點,石墨烯已被廣泛用于制備修飾電極,其中包括碳納米管、高纖維納米孔碳材料等?；谑┚薮蟮谋缺砻娣e,增大了生物分子的固定量,使生物傳感器具有更寬的線性范圍,較低的檢測下限,為構(gòu)建各種生物傳感器提出了一個比較好的平臺。辣根過氧化酶(HorseradishPeroxide,HRP)是從植物辣根中提取的一種含有血紅素的過氧化物酶,含有6條多肽鏈和6個血紅素輔基組成。辣根過氧化酶的主要功能是催化過氧化氫的還原反應(yīng)。近些年,HRP已用于建造第三代生物傳感器。HRP中的電活性中心與電極之間的電子傳遞速度很慢,因此研究酶的固定化材料和方法,使酶具有適宜的環(huán)境,保持其活性,具有良好的取向以加速電子傳遞過程是當前十分活躍的研究課題。本文采用Hummers和Offeman方法合成了氧化石墨,在蒸餾水中利用超聲分散將氧化石墨剝片,從而合成了氧化石墨烯(GO)。然后將氧化石墨烯與辣根過氧化酶(HRP)、三角形貌的金納米顆粒和殼聚糖混合后,固定到電極表面,構(gòu)筑生物傳感界面從而制成了辣根過氧化酶的第三代電化學(xué)生物傳感器,用于過氧化氫的檢測中。HRP酶傳感器的響應(yīng)靈敏度高,穩(wěn)定性較好,結(jié)果令人滿意。1實驗部分1.1試劑和試劑廠CHI660D電化學(xué)工作站(中國上海辰華儀器有限公司)。透射電鏡是由Philips,EM420型透射電鏡透射所得。使用三電極體系,其中自制修飾電極為工作電極;飽和甘汞電極為參比電極;鉑絲電極為對電極。辣根過氧化物酶(HRP,RZ>3.00,A>108.70U/mg)購于寶生物工程有限公司(大連);氯金酸(HAuCl4·4H2O,AR)購于昆明鉑銳金屬材料有限公司(昆明);H2O2(30.00%v/v水溶液)購于天津市大茂化學(xué)試劑廠(天津);H2O2消毒液(3.00%-3.50%)購于昆明南天化工藥業(yè)有限公司(昆明)。石墨粉購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司(天津)。殼聚糖(CHIT,Mw5×106-6×106,75-85%脫乙?；?購于美國Sigma公司。用NaH2PO4和Na2HPO4·12H2O配0.20mol/L(pH7.0)磷酸鹽緩沖溶液(PB)為測定的支持電解質(zhì)溶液。硼氫化鈉(NaBH496%)購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。濃硫酸、五氧化二磷、焦硫酸鉀、高錳酸鉀、氯化鋇、硝酸銀、乙醇、硝酸、檸檬酸三鈉等試劑均為分析純,水均為二次蒸餾水。1.2聚乙烯醇pv的合成將25.00mL0.01%氯金酸水溶液、1.00mL30.00mmol/L檸檬酸三鈉水溶液、1.50mL0.70mmol/L聚乙烯醇(PVP)與60.00μL30.00wt%過氧化氫混合在一起,在室溫下攪拌混勻,然后快速將250μL0.10mol/L硼氫化鈉加入到上述混合溶液里面,立即生成一種淡紅色的膠體,30min后膠體變?yōu)榫萍t色。整個實驗過程在暗處進行,制備好的膠體避光保存。1.3納米氧化石墨烯的開發(fā)1.3.1預(yù)氧化得到一定的525目粒度45。m1.3.2采用心理反應(yīng)時間將上一步晾干后的產(chǎn)物與460mL濃H2SO4置于三口燒瓶中,在0℃水浴中緩慢加入60gKMnO4,控制溫度不能高于20℃。再向三口燒瓶中加入920mL蒸餾水,維持反應(yīng)在35±3℃下進行2h。最后再加入2.8L蒸餾水和50mLH2O2,混合物由黃褐色變成亮黃色,約15min后終止反應(yīng)。1.3.3在蒸餾過程中氧化石墨用250mL1:10的HCl溶液洗滌、過濾上述反應(yīng)產(chǎn)物,以移除部分金屬離子。把經(jīng)稀鹽酸洗滌后的氧化石墨裝進透析袋中,在蒸餾水中進行透析,每2h更換一次蒸餾水,直至用BaCl2溶液檢驗濾液中無SO42-,且用AgNO3溶液檢驗無Cl-為止。然后將透析后的產(chǎn)物放入離心機中,在4000r.p.m.的速度下離心40min,移去少量未被氧化的天然石墨顆粒,得到的氧化石墨呈粘性、棕色膠體。在P2O5存在的條件下,于60℃真空干燥箱中真空干燥24h,密封保存待用。1.3.4超聲功率的確定取一定量的氧化石墨分別分散在水,攪拌3h,然后在100W超聲功率下超聲3h,使氧化石墨片層剝落,獲得棕色的分散液。在4000r.p.m.的速度下離心40min,移去離心沉淀物,即未剝落的氧化石墨,最終得到氧化石墨烯的分散液。1.4hrp/pr-aunps/go/cot混合涂膜的制備稱取0.02g的殼聚糖,溶于4mL醋酸溶液(0.05mol/L)中得到0.5%(W/V)的殼聚糖醋酸溶液,然后再取25μL的殼聚糖溶液與25μL的氧化石墨烯分散液,混旋1h,再取出25μL的上述混合物與100μLprismAuNPs超聲振蕩15min,接著再取出5μL的混合物與10μL的辣根過氧化酶混旋10min,就制成了所需要的HRP/prismAuNPs/GO/CHIT混合涂膜溶液。1.5電極制備和改性將玻碳電極(φ=3mm)在金相砂紙上打磨,接著用Al2O3懸濁液將電極表面拋光成鏡面,電極再依次放入硝酸(1:1)、乙醇、二次蒸餾水中各超聲洗滌5min,晾干。在預(yù)處理好的電極上點上5μLHRP/prismAuNPs/GO/CHIT混合涂膜溶液,過夜。用二次蒸餾水清洗,電極不用時,置于冰箱中4℃保存。1.6電化學(xué)池h電化學(xué)實驗在裝有10mL支持電解質(zhì)(PBpH7.0)的電化學(xué)反應(yīng)池中進行。計時電流測定在-0.1V電位下進行,待背景電流穩(wěn)定后,加入一定量的H2O2,記錄響應(yīng)電流值。2結(jié)果與討論2.1石墨烯的微觀形狀為了考察石墨烯的微觀結(jié)構(gòu),用透射電鏡觀察了氧化石墨烯的微觀形貌特征。由透射電鏡可看到氧化石墨烯呈薄片結(jié)構(gòu)(見圖2)。2.2金屬絲的微觀形態(tài)表達通過透射電鏡觀察了金三角的微觀形貌特征。由透射電鏡可以看出,所合成的金三角形態(tài)規(guī)整,呈三角形狀。如圖3所示。2.3-oh、-c-o利用KBr壓片,用紅外光譜儀進行測定,所得配合物紅外光譜見圖4:在3420cm-1左右為-OH峰,1733cm-1左右為-C=O峰,1380-1457cm-1左右為-C-H彎曲振動的峰,1080cm-1左右為-C-O-C-峰,2360cm-1為共軛-COOH峰,因為氧化石墨是黑色,透光率低,所以峰形較差。2.4用電極裝飾電極的電流2.4.1掃描速度的影響圖5比較了HRP/prismAuNPs/GO/CHIT/GC修飾電極在有無H2O2的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中的循環(huán)伏安圖。圖中由a曲線可觀察到背景電流。由b曲線可看出,當加入0.99mmol/LH2O2時,峰電流增加,證實了酶電極的對H2O2的催化作用?？疾炝藪呙杷俣葘Ψ咫娏鞯挠绊?當掃描速度從20到100mV/s變化時,傳感器在含有0.99mmol/LH2O2的緩沖溶液中的循環(huán)伏安行為如圖6。峰電流隨著掃描速度的增大而增加。同時為了考察電流的特性,將峰電流對掃描速度的平方根作圖(見內(nèi)置圖),從內(nèi)置圖可看出,峰電流與掃描速度的平方根成正比,說明此電流為擴散控制的電流。2.4.2納米金納米顆粒協(xié)同作用對過氧化氫活性的影響為了考察GO與納米金三角的協(xié)同作用,分別制備HRP/GO/CHIT/GCE、HRP/prismAuNPs/GO/CHIT/GCE、HRP/prismAuNPs/CHIT/GCE和CHIT/GCE四種不同傳感器。圖7為不同傳感器對過氧化氫的計時電流響應(yīng)。從圖7可以看出,HRP/prismAuNPs/GO/CHIT/GCE(b)的電流響應(yīng)大于HRP/GO/CHITGCE(a)、HRP/prismAuNPs/CHIT/GCE(c)和CHIT/GCE(d)。結(jié)果表明了氧化石墨烯與三角形貌的納米金顆粒的協(xié)同作用能增強HRP對H2O2的電流響應(yīng)。首先,納米金可作為細微的傳導(dǎo)中心,能實現(xiàn)電極與HRP間的直接電子傳遞,并且納米金具有較大的比表面積,能提供大量的活性位點吸附蛋白質(zhì)分子,石墨烯巨大的比表面積也提高了酶的負載量。殼聚糖具有很好生物相容性和成膜性并能將納米復(fù)合材料有效地粘著在電極表面,增加了傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。2.5實驗條件的優(yōu)化2.5.1電流直接下降考察了工作電位對電極響應(yīng)電流的影響,結(jié)果見圖8。在-0.5至+0.20V之間隨著電位下降,電流急劇上升。為避免溶解氧,Fe3+等干擾物在負電位下的還原,本實驗采用-0.10V作為工作電位。2.5.2緩沖液ph的影響在pH為5.89~8.49范圍內(nèi),工作電位為-0.10V下,考察了緩沖液的pH對傳感器的影響。結(jié)果見圖9.。在pH為7.0時,電極響應(yīng)最大。因此選擇pH7.0為本實驗的最佳pH。2.6酶電極活性檢測在優(yōu)化實驗條件下,在0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中,逐次加入100μL0.1mol/LH2O2得計時電流曲線如圖10?？梢?酶電極對H2O2的濃度變化有快速靈敏的響應(yīng),響應(yīng)時間為20秒,說明酶電極有優(yōu)良的電催化行為。校正曲線如內(nèi)置圖,響應(yīng)電流值隨H2O2濃度升高而增大。當H2O2達到一定濃度時電流也達到飽和,說明此時酶的活性位點被底物飽和。測定H2O2溶液的濃度線性范圍是1.48×10-5~2.99×10-2mol/L比黃要寬,檢測下限為4.8×10-6mol/L比朱的過氧化氫傳感器要要低。其中,回歸方程為:i=459.2439C+0.1937;相關(guān)系數(shù)為γ=0.9859;在圖中,i為響應(yīng)電流(μA),C代表H2O2的濃度(mol/L)。2.7hrp酶電極重現(xiàn)性和壽命在含0.99mmol/LH2O2的0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中考察了HRP酶電極響應(yīng)電流的重現(xiàn)性和壽命。用同一根電極3次連續(xù)測定,其相對標準偏差為1.5%,壽命為60天。2.8抗干擾性能為了考察電極的選擇性,在所選擇的測定條件,0.99mmol/LH2O2濃度下,加入不同濃度的草酸、酒石酸、水楊酸、丙氨酸、抗壞血酸、谷氨酸、檸檬酸、葡萄糖八種可能的干擾物質(zhì)(見表),響應(yīng)電流幾乎無變化,這表明以上物質(zhì)對酶電極響應(yīng)電流都沒有明顯干擾,此傳感器有優(yōu)良的抗干擾性能。2.9消毒水檢測為了考察酶電極的實用性,用其測定了市售消毒水(昆明某公司)的濃度,其測定結(jié)果與高錳酸鉀氧化還原滴定法測定值基本一致(如下表),說明該電極可用于H2O2檢測。3石墨的制備和生物傳感器的應(yīng)用將所合成的氧化石墨烯與三角形貌的金顆粒、辣根過氧化酶(HRP)和殼聚糖(CHIT)混合修飾到玻碳電極上制得過氧化氫傳感器。石墨烯巨大的比表面積提