安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理及其應用

安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理及其應用

轉(zhuǎn)換技術(shù)是研究基因功能和植物遺傳改良的重要工具。自1996年首例轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來,全球已累計批準25種轉(zhuǎn)基因作物進行商業(yè)化生產(chǎn),以抗除草劑和抗蟲為主的大豆、玉米、棉花、油菜等轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)在全球28個國家和地區(qū)種植,2012年種植面積已達1.7億公頃。轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)業(yè)已成為全球新的經(jīng)濟增長點,是增強農(nóng)業(yè)國際競爭力的重要保障。盡管轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅猛,但對其可能存在的潛在安全風險問題仍然受到公眾的普遍關(guān)注。轉(zhuǎn)基因作物的潛在安全風險主要是環(huán)境安全和食品安全風險。如在環(huán)境方面,由于花粉飄移可能形成超級雜草、增加靶標生物抗性、對生物多樣性影響等。在食品安全方面,包括轉(zhuǎn)入基因所表達蛋白質(zhì)致敏性,以及對受體作物本身營養(yǎng)成分、天然毒素和抗營養(yǎng)物質(zhì)含量等方面的影響及其他可能的非預期效應。此外,原核生物載體序列(骨架)和抗生素標記問題也會引起人們對轉(zhuǎn)基因植物的安全性產(chǎn)生顧慮。植物遺傳轉(zhuǎn)化方法很多,其中,根癌農(nóng)桿菌介導法(agrobacterium-mediatedtransformation)和基因槍轟擊法(particlebombardmenttransformation)是最常見的兩種轉(zhuǎn)化方法。農(nóng)桿菌介導法的轉(zhuǎn)化機理清楚、整合位點較穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、整合后的外源基因結(jié)構(gòu)變異較小、遺傳穩(wěn)定性好,但存在基因型限制和骨架序列整合的情況;基因槍轉(zhuǎn)化法不受材料基因型的限制,但存在著轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)多、沉默以及遺傳穩(wěn)定性等問題。建立精準、安全的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)的主要方向。目前,已報道了多種安全轉(zhuǎn)基因技術(shù),根據(jù)其原理和目的可分為以下四類:安全標記基因法、標記基因剔除與基因疊加、防止基因漂移的葉綠體轉(zhuǎn)化法和基因拆分法以及基因定點修飾技術(shù)。其中,標記基因剔除法包括共轉(zhuǎn)化法(co-transformation)、位點特異性重組法(site-specificrecombination)、轉(zhuǎn)座子法(transposon)、染色體同源重組法(intra-chromosomalrecombination)。外源基因定點修飾技術(shù)包括鋅指核酸酶介導的基因組定點修飾技術(shù)(zincfingernucleases,ZFNs)、TALE介導的基因組定點修飾技術(shù)(transcriptionactivator-likeeffector,TALEN)和基于typeⅡ型的CRISPR/Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedgene,CRISPR/Cas)系統(tǒng)的基因定點編輯技術(shù)。本文就這些安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理、應用和存在問題以及應用前景和發(fā)展方向進行了探討。1非轉(zhuǎn)化細胞生長類標記使用安全標記基因是消除標記基因潛在風險的重要方法。與抗生素和除草劑抗性標記基因相比,這類標記在選擇時并非直接殺死非轉(zhuǎn)化細胞,而是使轉(zhuǎn)化細胞處于有利的生長條件,使非轉(zhuǎn)化細胞生長受到抑制,從而篩選出轉(zhuǎn)化細胞,并且其基因和表達產(chǎn)物對人和其他生物無毒。目前,已開發(fā)了一系列安全標記基因。按其作用原理和選擇劑類型,可分為以下幾類(表1)。1.1amesim篩選糖代謝相關(guān)基因編碼的產(chǎn)物是某種糖類的分解代謝酶,通常植物細胞不能利用這些糖類作為主要碳源,但經(jīng)相關(guān)代謝酶作用可轉(zhuǎn)化為植物細胞可以利用的碳源。因此,在以該糖作為主要碳源的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化細胞能夠正常生長,而非轉(zhuǎn)化細胞生長受到抑制。目前使用較多的糖代謝相關(guān)標記基因是磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(phosphomannoseisomerase,pmi)。甘露糖本身對植物細胞是無毒的,但它通過己糖激酶轉(zhuǎn)化為甘露糖-6-磷酸時需消耗大量ATP,而且甘露糖-6-磷酸積累到一定濃度會抑制細胞的生長和發(fā)育。PMI能使甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸,從而被植物細胞利用。pmi選擇標記基因已成功應用于小麥、水稻、玉米、甜菜、油菜、木薯等的遺傳轉(zhuǎn)化研究。如Gadaleta等將甘露糖作為選擇劑,將大腸桿菌(E.coli)的pmi作為選擇標記基因應用于小麥的轉(zhuǎn)化研究,其平均轉(zhuǎn)化率為1.14%,其選擇效率可達90.1%,比用bar基因作為選擇標記時選擇效率(26.4%)大大提高。目前,PMI篩選系統(tǒng)作為先正達公司的PositechTM選擇技術(shù),已應用于轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化生產(chǎn)。然而,pmi篩選體系不適于那些自身含有內(nèi)源pmi的植物,如豆科類植物。木糖異構(gòu)酶基因(xyloseisomerase,xylA)作為糖代謝標記基因,其原理與pmi類似。XylA能異構(gòu)化D-木糖為D-木酮糖,在以D-木糖為篩選劑的培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)化細胞能利用D-木糖,而非轉(zhuǎn)化細胞生長受到抑制。Haldrup等發(fā)現(xiàn)xylA的篩選效率顯著高于nptII,該系統(tǒng)已成功應用于玉米、油菜、向日葵等的轉(zhuǎn)化。此外,也有報道將阿拉伯糖脫氫酶基因(arabitoldehydrogenase,atlD)、2-脫氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酯酶基因(2-deoxyglucose-6-phosphatephosphatases,DOGR1)等作為標記基因用于植物的轉(zhuǎn)化研究。1.2標記基因的選擇植物中某些氨基酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶受終產(chǎn)物的反饋抑制。利用這一特性,可將某些氨基酸代謝酶作為選擇標記基因。天冬氨酸激酶(aspartatekinase,AK)為賴氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶之一,其活性受賴氨酸或蘇氨酸的反饋抑制。Perl等以賴氨酸和蘇氨酸作為選擇劑,以大腸桿菌中對賴氨酸反饋抑制不敏感的lysC作為篩選標記基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯,發(fā)現(xiàn)含有l(wèi)ysC的轉(zhuǎn)化細胞能夠正常生長,而非轉(zhuǎn)化細胞生長受到抑制。Brinch等在大麥轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn),lysC作為篩選標記基因容易產(chǎn)生白化苗和嵌合體,具有一定的局限性。此外,其他對反饋抑制不敏感的鄰氨基苯甲酸合成酶(anthranilatesynthase,AS)基因ASA1、蘇氨酸脫氨酶(threoninedeaminase,TD)基因ilvA等也可作為篩選標記。植物代謝途徑中的氨基酸都為L-氨基酸,在植物體內(nèi)少量D-氨基酸的累積,便可造成細胞危害,因此,一些D-氨基酸代謝酶也可用作標記基因。Oskar等從Rhodotorulagracilis中分離到D-氨基酸氧化脫氨酶(D-aminoacidoxidase,DAO)基因dao1,DAO能夠把D-丙氨酸和D-絲氨酸轉(zhuǎn)化為無毒產(chǎn)物,同時也能把對植物有低毒性的D-異亮氨酸和D-纈氨酸轉(zhuǎn)化為有毒的產(chǎn)物,因此,dao1可作為雙向選擇標記基因。其他類似基因還有D-絲氨酸氨解酶(D-serineammonialyase,DSD)基因dsdA等。1.3其他細胞分裂基因在離體培養(yǎng)條件下,植物再生需要適宜的細胞分裂素和生長素比例。因此,通過在細胞中引入激素合成相關(guān)基因,從而提高芽的分化能力,也可作為篩選基因篩選轉(zhuǎn)化細胞。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒編碼的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)是幾種細胞分裂素前體物質(zhì)的合成酶,ipt的表達會促進轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)自身合成過量的激素,提高發(fā)芽和生根能力,而非轉(zhuǎn)化細胞則受到抑制。ipt已成功應用于煙草、水稻、白楊等植物的轉(zhuǎn)化,特別是利用誘導型啟動子控制ipt的表達篩選效果更加穩(wěn)定。此外,細胞分裂素受體基因CKI1、促進芽形態(tài)形成的增強子基因ESR1、發(fā)狀根基因rol、基于負選擇的β-葡萄糖醛酸酶基因uidA等也可以作為篩選基因。由于激素相關(guān)基因常會引起轉(zhuǎn)基因植株的畸形,可通過結(jié)合位點特異性重組酶系統(tǒng)或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建激素相關(guān)基因的選擇系統(tǒng),克服這種局限性。1.4抗性標記基因抗逆基因作為篩選標記已成功應用于植物轉(zhuǎn)化的有OsDREB2A、AtSOS1和rstB。OsDREB2A編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子,受干旱和高鹽誘導表達,AtSOS1編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因,受高鹽誘導表達。Zhu等]用200mmol·L-1NaCl作為篩選劑,分別將OsDREB2A和AtSOS1作為篩選基因應用于水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。rstB來自大豆根瘤菌RT19,編碼糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控胞外多聚糖的合成。Zhang等把rstB作為篩選基因應用于煙草的轉(zhuǎn)化,利用濃度為170mmol·L-1的NaCl作為選擇劑,其篩選效率最高可達83.3%?？傊?非抗生素或非除草劑抗性標記基因的使用,降低了轉(zhuǎn)基因植株的潛在風險。然而,隨著公眾對轉(zhuǎn)基因植物安全性意識的進一步提高,開發(fā)新型的尤其是植物來源的標記基因仍是一個重要研究方向。2基因共轉(zhuǎn)體改性技術(shù)目前,已發(fā)展了多種標記基因刪除技術(shù),包括共轉(zhuǎn)化法、表達盒轉(zhuǎn)化法、位點特異重組法以及基于位點特異性重組的基因疊加技術(shù)、轉(zhuǎn)座子法和染色體同源重組法等。2.1標記的共轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化法是通過將標記基因和目的基因分別構(gòu)建在不同載體或同一載體的不同T-DNA區(qū)域一同導入受體,通過轉(zhuǎn)基因植株自交后代的分離,獲得只含有目的基因而不含標記基因的轉(zhuǎn)化植株(marker-freetransgenicplants,MFTPs)。農(nóng)桿菌介導的共轉(zhuǎn)化法有三種形式:二質(zhì)粒二菌株法;二質(zhì)粒一菌株法;一質(zhì)粒一菌株法(圖1),具有操作簡單、適用性廣,且較易產(chǎn)生非連鎖位點的特點。共轉(zhuǎn)化法已經(jīng)應用于煙草、擬南芥、油菜、水稻、大麥和玉米的轉(zhuǎn)化研究。目前,研究較多的是一質(zhì)粒一菌株法,即雙T-DNA法,同一質(zhì)粒上含有2個或多個T-DNA。Komari等使用此法轉(zhuǎn)化煙草和水稻,發(fā)現(xiàn)其共轉(zhuǎn)化率達47%,其中,50%的轉(zhuǎn)化植株目的基因和標記基因位于不同位點,研究發(fā)現(xiàn)雙T-DNA共轉(zhuǎn)化效率與T-DNA的相對大小有關(guān)。此外,通過把標記基因構(gòu)建到T-DNA左邊界外,目的基因位于T-DNA內(nèi),通過共轉(zhuǎn)化,也可以獲得無標記轉(zhuǎn)化植株。利用共轉(zhuǎn)化法獲得無選擇標記植株,有3個關(guān)鍵因素:轉(zhuǎn)化體系有較高的共轉(zhuǎn)化率、T-DNA可整合到不連鎖位點、后代通過自交或雜交發(fā)生分離。因此,共轉(zhuǎn)化法不適于無性繁殖的作物和生殖時間較長的物種。2.2表達盒轉(zhuǎn)化法通常利用農(nóng)桿菌或基因槍介導法獲得的轉(zhuǎn)化植株,除了含有標記基因外,還會帶有部分載體骨架序列。而載體骨架序列的存在可能會引起基因的重排,并且對外源基因或內(nèi)源基因的表達有一定的影響。因此,在剔除標記基因的同時,減少骨架序列整合的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的開發(fā)受到重視?；驑尳閷У谋磉_盒共轉(zhuǎn)化法是一個有效的方法。該方法是把含目的基因的最小表達盒和含選擇基因的最小表達盒,混合共轉(zhuǎn)化受體,通過后代的分離獲得無選擇標記的植株。Fu等首次獲得了穩(wěn)定表達bar表達盒的轉(zhuǎn)基因水稻植株,同時發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)化環(huán)型質(zhì)?；蚓€性質(zhì)粒相比,轉(zhuǎn)表達盒的植株中bar整合形式簡單,拷貝低,基因重排率低。Breitler等研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)表達盒和轉(zhuǎn)質(zhì)粒時的轉(zhuǎn)化效率,沒有顯著差異。Zhao等把bar表達盒和水稻白葉枯抗病基因cecropinB通過基因槍法共轉(zhuǎn)化水稻,并在后代的分離中獲得了無bar的植株,其無標記轉(zhuǎn)基因植株的獲得率約為6%。表達盒轉(zhuǎn)化法在葡萄、馬鈴薯等植物中也已成功應用。另外,有試驗表明,降低表達盒DNA濃度可以提高單拷貝的轉(zhuǎn)化體頻率。染色質(zhì)中與核基質(zhì)(或核骨架)相結(jié)合從而將染色質(zhì)固定于核基質(zhì)的DNA序列稱為基質(zhì)附著區(qū)(matrixattachmentregions,MARs)或骨架附著區(qū)(scaffoldattachmentregions,SARs)。MARs與SARs無本質(zhì)區(qū)別,區(qū)別在于制備核基質(zhì)時去除組蛋白步驟所用方法不同。MARs是位于染色質(zhì)端粒附近的一段保守DNA序列,通常富含TA,長度一般為100bp至數(shù)千bp不等,能使染色質(zhì)上間隔5—200kb的序列形成環(huán)狀獨立結(jié)構(gòu),提高基因的表達與穩(wěn)定性。因此,利用此特性可把MARs序列置于外源基因的兩翼,從而使外源基因整合到染色質(zhì)獨立結(jié)構(gòu)區(qū)域,在一定程度上減少基因沉默,提高外源基因的穩(wěn)定表達。鄧智年等采用農(nóng)桿菌介導法將帶有MARs和不帶MARs的野莧菜凝集素基因(AmaranthusviridisL.agglutinin,AVA)轉(zhuǎn)入白菜,發(fā)現(xiàn)利用MARs序列不僅能提高AVA的表達水平,降低株系間表達差異,同時也能提高轉(zhuǎn)化效率。Allen等把來源于雞和煙草的MARs序列置于gus兩側(cè),通過基因槍轉(zhuǎn)化煙草懸浮細胞,發(fā)現(xiàn)gus表達水平分別提高了24倍和140倍。與動物相比,在植物中的MARs序列研究雖然起步較晚,但已從多種植物中分離得到具有MARs活性的DNA片段,包括大豆、玉米、高粱、豌豆、水稻、擬南芥、胡蘿卜等。盡管植物中MARs的作用機制尚不清楚,但其在提高外源基因表達水平、降低轉(zhuǎn)化體間表達差異以及減少基因沉默等方面的作用,對今后植物的安全轉(zhuǎn)基因研究將有重要意義。2.3基于位點特異性重組法的基因疊加2.3.1位點特異性重組法介導的標記基因刪除同源重組在植物中是一種普遍現(xiàn)象。在噬菌體中存在一種重組系統(tǒng),即重組只發(fā)生噬菌體和細菌染色體的特定位點,通常稱作特異性重組位點。特異性重組位點由中間7—12bp的核心序列和兩側(cè)的回文序列構(gòu)成,重組發(fā)生在重組酶蛋白結(jié)合區(qū)和核心序列間。當重組位點方向相同時,發(fā)生重組時就會刪除兩位點間的序列,可用于標記基因的刪除,其原理見圖2。目前應用于標記基因刪除的主要有:來自于噬菌體P1的Cre/loxP重組系統(tǒng)、來自于釀酒酵母的FLP/FRT重組系統(tǒng)和來自于魯氏酵母的R/RS重組系統(tǒng),其中,Cre、FLP和R為重組酶,loxP、FRT和RS為其特異性重組位點。目前,應用較多的是Cre/loxP重組系統(tǒng),把Cre重組酶通過再轉(zhuǎn)化引入轉(zhuǎn)基因植株中或把重組酶Cre的轉(zhuǎn)化植株與loxP轉(zhuǎn)基因植株雜交,通過Cre在轉(zhuǎn)基因植株中的表達激活重組系統(tǒng),從而刪除標記基因。但此法需要再轉(zhuǎn)化或雜交,操作相對繁瑣。此外,重組酶在轉(zhuǎn)基因植株中的表達常引起植株表型的變異。為了解決這一問題,Gleave等通過Cre重組酶在轉(zhuǎn)基因煙草中的瞬時表達,實現(xiàn)了標記基因的刪除,說明重組酶的瞬時表達也可刪除標記基因,并避免了再轉(zhuǎn)化和雜交過程?；诖嗽?Kopertekh等構(gòu)建了基于PotatoVirusX的PVX-Cre載體,通過Cre在煙草中的瞬時表達誘導重組,其重組率為42%—48%。此外,Zuo等構(gòu)建了β-雌激素誘導的CLX載體系統(tǒng)(圖3),β-雌激素可激活啟動子G10-90誘導轉(zhuǎn)錄因子XVE的表達,XVE與LexA操縱子作用激活Cre-int的表達,誘導loxP位點的重組,把位于兩位點間的XVE、nptII和Cre-int切除掉,并使GFP表達,該體系在擬南芥中已被驗證有效。Luo等發(fā)現(xiàn)Cre/loxP和FLP/FRT雙重組系統(tǒng)的結(jié)合使用,可提高重組酶介導外源基因的刪除效率。通過花粉或種子特異性啟動子表達Cre或FLP重組酶,在T1煙草種子中驗證其刪除率,平均刪除率為33%—79%,部分植株中刪除率可達100%。該技術(shù)為解決外源基因隨花粉漂移或食用組織部分剔除目標基因提供了有效方法。然而,該技術(shù)需要分離受體植物花粉或種子中的特異性啟動子,同時目的基因的刪除將不利于轉(zhuǎn)基因作物的制種和留種,因此,該法在轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)和商業(yè)化應用中有一定的局限性。2.3.2基于位點特異性重組法的基因疊加技術(shù)與Cre/loxP、FLP/FRT和R/RS重組系統(tǒng)相對應,phiC31-att和Bxb1-att重組系統(tǒng)(phiC31和Bxb1為重組酶,att為其對應的特定識別重組位點)稱之為不可逆重組系統(tǒng)。與可逆重組系統(tǒng)識別位點相比,不可逆重組系統(tǒng)識別位點為非同源序列,即發(fā)生重組后產(chǎn)生的新位點與原來位點不會再發(fā)生重組。Ow基于此提出了可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中基因定點疊加的方法(圖4),通過將連接有不可逆重組位點的可逆重組系統(tǒng),引入基因組中,然后通過2個不可逆重組位點的交替使用,可順次引入外源基因,而可逆重組位點,可刪除marker基因和每次基因疊加時的非必須序列。另外利用該系統(tǒng)還可進行表達盒的定點替換、插入位點外源基因的刪除和單拷貝植株的產(chǎn)生。Yau等將此系統(tǒng)用于煙草的轉(zhuǎn)化,成功實現(xiàn)了基因的定點整合,整合效率可達10%,并獲得了無標記轉(zhuǎn)化植株。利用該系統(tǒng)只要獲得首輪轉(zhuǎn)化時穩(wěn)定表達的位點,以后就可通過定點整合把基因插入到該位點,實現(xiàn)基因的疊加或通過表達盒的交換引入新的基因,減少基因隨機插入的盲目性。目前該技術(shù)仍處于研究階段,還存在一些未知的影響因素,如基因的疊加對外源基因的表達是否有影響、基因間的調(diào)控元件對相鄰基因的表達是否有影響、基因疊加過程中可能出現(xiàn)的基因沉默對后續(xù)基因疊加的影響,另外多輪轉(zhuǎn)化時間漫長也是不可忽略的問題。Lin等基于位點特異性重組系統(tǒng)開發(fā)了可進行多基因疊加和傳遞大片段的載體系統(tǒng),可有效解決Ow提出的基因定點疊加法可能出現(xiàn)的一些不利影響。該系統(tǒng)包括2個過程,首先在大腸桿菌中構(gòu)建多基因疊加的雙元載體,然后把攜帶有多基因的表達載體導入農(nóng)桿菌進行大片段的轉(zhuǎn)化,創(chuàng)建多基因疊加的轉(zhuǎn)基因植株。多基因表達載體的構(gòu)建,是通過Cre/loxP重組系統(tǒng)介導的多輪重組和歸位內(nèi)切酶的多次切割和連接,交替把2個中間載體中的外源基因順次連接到目的載體TAC(transformation-competentartificialchromosome,TAC)中(圖5),TAC載體可以高效地傳遞大片段DNA。通過此系統(tǒng)作者構(gòu)建了含10個外源基因結(jié)構(gòu)的TAC表達載體,并成功轉(zhuǎn)入水稻基因組中,除發(fā)現(xiàn)一個轉(zhuǎn)水稻內(nèi)源基因發(fā)生基因沉默外,其余基因都可共表達,并且把選擇基因和目的基因分別置于2個獨立的T-DNA中,以期通過后代的分離,獲得無標記轉(zhuǎn)化植株。該方法大大節(jié)省了基因疊加的時間,且體外基因疊加,減輕了多次轉(zhuǎn)化進行疊加的工作量。對于抗病、抗旱等植物復雜性狀的改良,單個基因往往無法達到預期效果,位點特異性重組系統(tǒng)在基因疊加中展現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性,不僅可縮短育種年限,加快多性狀復合品種的產(chǎn)生,而且顯著提高了轉(zhuǎn)基因植物的安全性,有望成為未來植物轉(zhuǎn)基因研究和安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)的重要技術(shù)之一。但目前的研究僅局限于煙草和水稻,尚需加強在其他重要農(nóng)作物中的研究和利用。2.4ipt標記基因轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)目前用于標記基因刪除研究的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)主要是來源于玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng),刪除策略主要有兩種。一是把標記基因置于轉(zhuǎn)座子內(nèi),與位于同一T-DNA內(nèi)的目的基因共轉(zhuǎn)化受體。在當代轉(zhuǎn)基因植株中標記基因隨轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位到別的位點,通過轉(zhuǎn)基因植株子代的分離可獲得無標記轉(zhuǎn)化植株(圖6)。Ebinuma等基于此策略構(gòu)建了ipt標記基因的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(multi-auto-transformation,MAT),其中,ipt位于Ac轉(zhuǎn)座子間,起一個雙重功能正向選擇功能和負向選擇功能。在煙草和白楊轉(zhuǎn)化試驗中發(fā)現(xiàn),無標記轉(zhuǎn)化植株的獲得率較低(0.032%),但Ac轉(zhuǎn)座頻率可達5%。MAT系統(tǒng)無需有性繁殖即可獲得無標記轉(zhuǎn)化的植株,適合于無性繁殖的植物。此外,在轉(zhuǎn)基因植株中只存在目的基因,也是實現(xiàn)多基因累加的一種途徑。另一種策略是把目的基因置于轉(zhuǎn)座子內(nèi),使目的基因隨轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位到不連鎖位點,通過轉(zhuǎn)基因植株后代的分離獲得無標記轉(zhuǎn)化植株。此方法的優(yōu)點是轉(zhuǎn)化體不攜帶T-DNA或其他非冗余序列,能產(chǎn)生“clean-gene”的插入。該方法最先應用于番茄轉(zhuǎn)化,并獲得了無標記轉(zhuǎn)化植株。Cotsaftis等用同樣的方法,獲得無選擇標記的轉(zhuǎn)cry1B水稻,其轉(zhuǎn)位頻率為25%,同時證明cry1B可高效表達,說明轉(zhuǎn)位后的再插入對目的基因表達無影響。由于該方法刪除選擇標記是在轉(zhuǎn)基因植株后代分離過程中完成的,因此,不適于無性繁殖的作物。2.5標記基因刪除技術(shù)染色體同源序列間發(fā)生重組是自然界普遍存在的一種現(xiàn)象。同源重組會導致2個同源序列間的片段發(fā)生倒置、互換、插入和缺失。如果重組發(fā)生在2個同向的同源序列間,則同源序列間的片段就會被切除(圖7)。Zubko等把標記基因置于噬菌體附著位點attP的同向重復序列間,獲得無標記轉(zhuǎn)化煙草,同源重組頻率達13.0%。attP重組引發(fā)機制尚不清楚,但attP序列富含A+T堿基,推測其與同源重組的引發(fā)相關(guān),重組的形成可能是由雙鏈斷裂誘導引起的。另外,Galliano等研究發(fā)現(xiàn),當把矮牽牛中的轉(zhuǎn)化增強序列(transformationboostersequence,TBS)置于attP位點附近時,可提高其在矮牽牛、煙草、玉米中的同源重組頻率。同源重組技術(shù)的優(yōu)點是通過一步篩選即可得到無標記植株、無需再轉(zhuǎn)化和有性雜交、無需蛋白酶的參與,但同源重組頻率偏低是限制其應用的一個關(guān)鍵因素?？傊?標記基因刪除技術(shù)不僅消除了轉(zhuǎn)基因植株中標記基因可能引起的潛在風險,同時也為創(chuàng)造多基因或多性狀疊加的轉(zhuǎn)基因植株提供了有利條件。隨著技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,在重要農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化中必將發(fā)揮重要作用。3葉綠體基因檢測外源基因?qū)肴~綠體基因組的方法主要有基因槍轉(zhuǎn)化法、PEG介導轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法和顯微注射法]等,目前主要采用前兩種方法。采取的主要策略有:(1)利用葉綠體特異啟動子、終止子及5′-UTR和3′-UTR區(qū)序列實現(xiàn)目的基因在葉綠體的高效表達;(2)利用同源重組的方式,將外源基因特異重組到葉綠體基因組的特定位點;(3)利用篩選標記基因?qū)崿F(xiàn)外源基因在葉綠體基因組中的同質(zhì)化。1988年,Boynton等首次在低等植物衣澡實現(xiàn)基因的葉綠體轉(zhuǎn)化。1990年,Svab等利用基因槍法,將rrn16導入到煙草葉綠體中,實現(xiàn)了高等植物葉綠體的基因轉(zhuǎn)化。隨后,葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)也成功應用于馬鈴薯、番茄[和茄子等植物。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在禾本科作物中的應用較晚,直到2006年,Lee等才成功實現(xiàn)了水稻葉綠體的轉(zhuǎn)化。目前,利用基因槍介導的葉綠體轉(zhuǎn)化法已成功用于甘藍、油菜、胡蘿卜、棉花、大豆和白楊等。葉綠體轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是:(1)外源基因可高效表達,表達量可以達到核表達的幾百倍;(2)可進行多基因的轉(zhuǎn)化,并且適用于真核基因和原核基因的表達;(3)定點整合,無位置效應,不易產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象;(4)葉綠體為母系遺傳,外源基因不會隨花粉漂移。缺點是:(1)葉綠體基因組拷貝數(shù)高,同質(zhì)化困難;(2)水稻、小麥及玉米等禾本科作物再生困難,前質(zhì)體與葉綠體基因組的表達調(diào)控不同,外源基因的同源重組率太低,同質(zhì)轉(zhuǎn)化也較為困難。4inten基因片段的擴增和重組基因拆分技術(shù)是為了降低基因漂移可能帶來的環(huán)境風險而發(fā)展起來的一項新技術(shù)?；虿鸱质墙⒃诘鞍變?nèi)含肽(Intein)及其介導的蛋白剪接基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其作用原理為:將目的基因拆分成2個基因片段,分別與Intein兩個剪接域的基因序列結(jié)合,形成融合基因。翻譯后形成的2個融合蛋白通過Intein介導的蛋白剪接,將Intein自身從前體蛋白中切除,同時將外源基因片段編碼的蛋白序列連接起來,形成一個完整的、有功能的蛋白(圖8)。目前研究較多的是來自集胞藻屬(Synechocystis)的DnaEIntein(SspDNaEIntein),屬于反式剪接Intein。2003年,Chin等和Yang等首次證明了Intein在植物中可正常行使作用。Chin等將抗草甘膦基因EPSPS拆分成兩部分,其N端部分與SspDNaEInteinN端融合形成EPSPSn-In,C-端部分和SspDNaEInteinC端部分融合形成Ic-EPSPSc,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將EPSPS-In轉(zhuǎn)入煙草核基因組中,利用同源重組法將Ic-EPSPSc轉(zhuǎn)入煙草葉綠體中,證明了無論Intein基因片段在葉綠體中表達還是被拆分在葉綠體和核基因組中表達,Intein介導的剪接都能發(fā)生,且重組蛋白功能正常。Katja等將來自芽孢桿菌的花粉不育基因(barnase)和來自水稻的乙酰乳酸合成酶(Acetolactatesynthase)基因進行基因拆分,并在小麥中成功實現(xiàn)了兩個基因的重組,獲得了基因功能正常的轉(zhuǎn)基因植株。目前,Intein介導基因拆分技術(shù)還處于起步階段,主要集中在模式植物如煙草、擬南芥中進行研究。由于Intein介導的基因拆分技術(shù)需要通過雜交,獲得目的基因正常表達的轉(zhuǎn)基因后代,在雜種優(yōu)勢較強的水稻和玉米等作物利用前景更大,在雜種優(yōu)勢不明顯的農(nóng)作物中有一定的局限性。5a片段對染色體的整合植物基因定點修飾是指外源DNA片段與受體同源片段發(fā)生重組,使外源DNA片段整合到染色體的預定位點(基因打靶)。與通常的基因敲除(如T-DNA標簽、轉(zhuǎn)座子標簽及逆轉(zhuǎn)座子標簽)相比,植物基因定點修飾技術(shù)不僅能實現(xiàn)基因定點整合,而且可對靶基因進行精細改造(缺失或插入)。5.1抗雜草基因的位點整合鋅指核酸酶(ZFNs)是由一個DNA識別域和一個非特異性的核酸內(nèi)切酶組成的一種融合蛋白,廣泛存在于動植物中。其中,DNA識別域由一系列Cys2-His2鋅指蛋白(zinc-fingers)串聯(lián)組成,識別一段特異的DNA序列,與鋅指蛋白相連的非特異性核酸內(nèi)切酶是來自海床黃桿菌的一種限制性內(nèi)切酶FokⅠ,該酶是一種typeⅡS類的限制性內(nèi)切酶,只有在形成二聚體時才具有酶切活性,可大大降低隨機剪切的幾率。ZFNs轉(zhuǎn)化細胞后,鋅指蛋白特異性地結(jié)合識別位點,當兩個鋅指蛋白分子相距恰當距離時(6—8bp),FokⅠ形成二聚體,恢復酶切活性,特異性地切斷DNA,形成雙鏈斷裂缺口(doublestrandbreak,DSB)。雙鏈斷裂可引起細胞內(nèi)的DNA損傷修復,即非同源重組末端連接(non-homologousend-joining,NHEJ)和同源重組(homologousrecombination,HR)。NHEJ修復機制可引起靶位點小片段的插入或缺失,從而引起基因的靶向敲除。當細胞中存在與靶位點同源的DNA片段時,則細胞主要以同源重組的方式修復斷裂的雙鏈DNA,實現(xiàn)目標片段的定點整合(圖9)。ZFNs技術(shù)最早應用于果蠅的研究中,此后在斑馬魚、大鼠、小鼠等動物中用于基因定點突變研究。ZFNs技術(shù)在植物中的研究起步較晚,目前主要用于模式植物中基因突變和修復研究。Lloyd等把設(shè)計的ZFNs基因與誘導啟動子相連轉(zhuǎn)入擬南芥,通過誘導啟動子的活性,實現(xiàn)了基因定點突變,首次證明ZFNs在植物細胞內(nèi)具有正常功能,其非同源末端連接頻率為7.9%。將ZFNs用于煙草基因的定點修飾研究,結(jié)果顯示其非同源末端連接頻率約為2%,定點整合頻率可達10%。Shukla等把玉米肌醇激酶基因(inositol-1,3,4,5,6-pentakisphosphate2-kinasegene,IPK1)作為靶位點,篩選出2對在基因第二外顯子上特異結(jié)合的ZFNs,轉(zhuǎn)化玉米后,實現(xiàn)了在IPK1基因第二外顯子上的定點突變和小片段的插入。同時,實現(xiàn)了抗除草劑基因PAT在IPK1內(nèi)的定點整合,其整合頻率最高可達22%。然而作為一種新興基因定點修飾工具,ZFNs仍存在一些亟待解決的問題,如ZFNs的非特異性結(jié)合,即脫靶現(xiàn)象嚴重;ZFNs對細胞的毒性和作用位點有限等。5.2tali基因序列缺失導致無法動態(tài)性損傷TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)由TALE蛋白和FokⅠ核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域人工融合而成,是最近幾年發(fā)展起來的一種用于基因組定點修飾的分子工具。TALE基因早在1989年從Xanthomonascampestrispv.Vesicatoria中被克隆,但TALE蛋白的氨基酸序列與核酸特異識別序列的對應關(guān)系,直到2009年才被破譯。TAL的核酸識別單位為34個重復氨基酸序列,其中的12、13位點的氨基酸與A、G、C、T有恒定的對應關(guān)系,即NG識別T,HD識別C,NI識別A,NN識別G或A。為獲得識別某一特定核酸序列的TALE,只須按照DNA序列將相應TAL單元串聯(lián)克隆即可。將識別特異序列的TALE與非限制性內(nèi)切核酸酶FokⅠ偶聯(lián)后,便形成可定點剪切的內(nèi)切酶TALENs,當轉(zhuǎn)入細胞后便可在特定識別位點剪切形成雙鏈斷裂切口,誘發(fā)細胞內(nèi)的DNA損傷修復(圖10)。TALEN技術(shù)已成功應用于酵母、線蟲、人類細胞和斑馬魚的研究。在植物研究中,Mahfouz等將特異識別擬南芥RD29A啟動子區(qū)的dHax3TALE與EAR轉(zhuǎn)錄抑制域(EAR-repressiondomain,SRDX)偶聯(lián),構(gòu)建了可定點抑制RD29A轉(zhuǎn)錄的抑制子(dHax3.SRDX),并轉(zhuǎn)化擬南芥,發(fā)現(xiàn)dHax3.SRDX蛋白可高效抑制RD29A::LUC轉(zhuǎn)基因擬南芥中LUC的表達和擬南芥內(nèi)源RD29A的表達,說明TALEs可用于植物靶向基因定點修飾研究,為植物基因功能研究提供了一個新的工具。Li等利用TALENs技術(shù)通過對水稻白葉枯病敏感基因Os11N3的修飾,獲得了穩(wěn)定遺傳的抗病植株,顯示出TALENs介導的基因定點修飾在作物遺傳改良中具有重要應用前景。與ZFNs技術(shù)相比,TALEN定點修飾技術(shù)有以下優(yōu)點:(1)TALE便于設(shè)計和預測;(2)試驗設(shè)計簡單、準確、周期短、成本低;(3)毒性低、脫靶情況少等優(yōu)點。5.3crispr/cas9系統(tǒng)CRISPR/Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedgene,CRISPR/Cas)是廣泛存在于細菌或古生菌中的一種獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPR位點是位于細菌染色體上或質(zhì)粒上的一段特異DNA序列,由一系列短的高度保守的正向重復序列和與之長度相似的間隔序列(spacers)間隔排列組成。Cas基因是與CRISPR重復序列相連的保守的CRISPR相關(guān)蛋白基因。根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同CRISPR/Cas有3種類型,其中,TypeⅡ型系統(tǒng)的核糖核蛋白復合物相對簡單,包括crRNA(CRISPRRNAs)和tracrRNA(trans-activating,crRNA)和一個Cas9蛋白,是研究者主要研究的一個系統(tǒng)。Cas9蛋白含有HLH和RuvC-like兩個核酸酶結(jié)域,是CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)中的基本組成成分。當細菌受到噬菌體或外源質(zhì)粒侵染時,CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠把外源DNA的一段特定序列(protospacer)整合到其5端的2個重復序列間,當細菌再次受到侵染時,protospacer會轉(zhuǎn)錄生成crRNAs,并與tracrRNA、Cas9蛋白形成一種核糖核蛋白復合物,該復合物能夠特異性地識別噬菌體DNA或質(zhì)粒上的PAM(protospaceradjacentmotif,PAM)及protospacer序列,然后Cas9蛋白的2個核酸酶結(jié)構(gòu)域分別切割PAM上游與crRNA互補的DNA區(qū)域,從而防止噬菌體的侵染和外來質(zhì)粒的進入(圖11)。基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異識別切割特點,將tracrRNA和crRNA形成嵌合RNA分子,稱為向?qū)NA(guideRNA,gRNA),CAS蛋白在gRNA的指導下,可對靶序列進行切割,引起DSBs,誘發(fā)細胞內(nèi)的DNA損傷修復(圖12)。目前應用較為成功的是經(jīng)過改造的來自產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。Jinek等首次實現(xiàn)了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘發(fā)的DNA雙鏈斷裂,為CRISPR/Cas9的進一步應用提供了基礎(chǔ)。Cong等首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人293T細胞的EMX1和PVALB以及小鼠Nero2A細胞的Th實現(xiàn)了定點突變,目前CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應用于大腸桿菌、肺炎雙球菌、釀酒酵母、斑馬魚、果蠅、線蟲、小鼠和大鼠中。最近,CRISPR/Cas9在植物中的應用也取得了重大突破,Nekrasov等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實現(xiàn)了煙草基因PDS(phytoenedesaturase)的定點突變,突變率為1.8%—2.4%,平均率為2.1%。Li等利用CRISPR/Cas9在擬南芥和煙草中也成功實現(xiàn)了基因組的定點突變,其突變率為1.1%—38.5%,并發(fā)現(xiàn)突變效率與gRNA的表達量有關(guān);同時證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可同時對多基因或單基因的多個位點進行定點編輯。Shan等對水稻的OsPDS、OsBADH2、Os02g23823和OsMPK24個基因以及小麥TaMLO實現(xiàn)了定點突變,在轉(zhuǎn)基因水稻中的突變效率為7.1%—9.4%。此外CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因表達調(diào)控上也展現(xiàn)出巨大應用前景。Lei等把Cas9蛋白失活,使之失去核酸內(nèi)切酶活性,然后通過在基因位點或基因轉(zhuǎn)錄位點設(shè)計靶位點,由于sgRNA與靶位點的特異結(jié)合,導致基因在靶位點處轉(zhuǎn)錄受阻從而抑制基因的表達,利用此系統(tǒng)成功在大腸桿菌和人類細胞中實現(xiàn)了靶基因的沉默(圖12)