第七章 制作課件 抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用

第七章抗原抗體反

應(yīng)及應(yīng)用

基本內(nèi)容第一節(jié)抗體的制備和應(yīng)用第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用第一節(jié)抗體的制備抗血清的制備單克隆抗體的制備基因工程抗體的制備抗體的制備抗體種類：第一代抗體

多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體

單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體

基因工程抗體（geneticengineeringantibody)技術(shù)路線免疫動(dòng)物抗血清的純化與保存抗血清的特性鑒定（效價(jià)、親和力、特異性）（飽和硫酸胺鹽法和層析法）一、抗血清的制備二、單克隆抗體的制備單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）

由單一克隆B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的，只識(shí)別抗原分子某一特定抗原決定簇的特異性抗體。特點(diǎn)：具有高度均一性。雜交瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞———無(wú)限增殖；免疫B細(xì)胞———合成、分泌特異性抗體。

細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫（一）免疫小鼠

動(dòng)物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）骨髓瘤細(xì)胞篩選標(biāo)準(zhǔn)：1.瘤細(xì)胞本身不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生抗體的某種鏈，但不能分泌。2.是次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。（三）細(xì)胞融合細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開(kāi)而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑

T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNA骨髓瘤細(xì)胞:

HGPRT-，TK-;死亡脾細(xì)胞:

HGPRT+，TK+;短命(3天)雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+，TK+;長(zhǎng)命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞密度過(guò)低不利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中MQ還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過(guò)2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化。飼養(yǎng)細(xì)胞特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含1個(gè)細(xì)胞有限稀釋法（四）陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化單克隆抗體的擴(kuò)大生產(chǎn)腹水制備大瓶培養(yǎng)中空纖維反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：在體外“永久”地存活并傳代用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高

McAbPcAb

抗原要求可以不純純度高特異性高低穩(wěn)定低高成本高低McAb與PcAb的比較五、單克隆抗體的應(yīng)用1、作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑2、作為親合層析的配體3、作為生物治療的導(dǎo)向武器三、基因工程抗體的制備基因工程抗體（geneticengineeringantibody）在DNA水平對(duì)Ig基因進(jìn)行切割、拼接或修飾，導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)的抗體。如：人-鼠嵌合抗體（chimericantibody）改型抗體（reshapedhumanizedantibody）小分子抗體：Fab片段Fc片段Fv片段雙特異性抗體（bispecificantibody），如：Ig-融合蛋白，抗體導(dǎo)向酶等。嵌合抗體第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)及其應(yīng)用

最早建立的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)Ag，Ab特異性結(jié)合原理用已知Ag檢測(cè)血清中未知Ab，故稱為血清學(xué)反應(yīng)。隨著免疫學(xué)理論的進(jìn)展及相關(guān)學(xué)科新技術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用，近年來(lái)建立了不少免疫學(xué)新技術(shù)。這些新技術(shù)不僅推動(dòng)了免疫學(xué)的發(fā)展也是輔助疾病的診斷，療效評(píng)估和探討疾病機(jī)制的重要手段。一、抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)影響因素

（一）抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn):

1.高度特異性：2.可逆性:抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡,其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab抗體的親和力：抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]3.適當(dāng)濃度和比例:

Ab過(guò)剩4.敏感性:在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。（二）影響抗原抗體反應(yīng)的因素:

1.電解質(zhì)

：抗原抗體特異結(jié)合后，膠體粒便可發(fā)生脫水作用，此時(shí)易受電解質(zhì)影響，如有適當(dāng)濃度的電解質(zhì)存在就會(huì)使它們失去部分負(fù)電荷而相互凝聚，于是出現(xiàn)明顯的凝集或沉淀現(xiàn)象。2.酸堿度:合適的pH為6-8。3.溫度:37度通常是抗原體反應(yīng)最適溫度。二、抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素，可將抗原抗體反應(yīng)分為：凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參與的反應(yīng)中和反應(yīng)采用標(biāo)記物的抗原抗體反應(yīng)等

（一）凝集反應(yīng)（agglutination）顆粒性抗原（紅細(xì)胞、細(xì)菌、乳膠顆粒等）與抗體特異性結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)的凝集塊。1、直接凝集(directagglutination)

玻片凝集、試管凝集2、間接凝集（indirectagglutination）

可溶性抗原或抗體包被在乳膠顆?；蚣t細(xì)胞表面，與相應(yīng)抗體或抗原混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。正向間接凝集試驗(yàn)反向間接凝集試驗(yàn)