非標(biāo)記酸灌注法產(chǎn)生丙酸的速率及液相吸收的研究

非標(biāo)記酸灌注法產(chǎn)生丙酸的速率及液相吸收的研究

首先，研究表明，山羊丙酸對(duì)腫瘤胃的吸收率為64%-79%。但是,這些研究條件一般不能保持正常的瘤胃發(fā)酵條件,其結(jié)果的適應(yīng)性具有局限性。隨著我國(guó)對(duì)飼喂優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)肉羊的重視,研究在高產(chǎn)性能下因瘤胃丙酸產(chǎn)生量增加引起吸收規(guī)律的變化應(yīng)予重視。而至目前為止,除Peters等報(bào)道了利用同位素標(biāo)記揮發(fā)性脂肪酸(VFA,下同)法直接測(cè)定飼料碳水化合物在反芻動(dòng)物瘤胃原位置的產(chǎn)生速率外,有關(guān)采用直接測(cè)定VFA產(chǎn)生速率的方法及研究報(bào)道甚少。本試驗(yàn)先研究在模擬連續(xù)飼喂條件下瘤胃丙酸的基本產(chǎn)生速率(飼料碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的),然后通過(guò)連續(xù)灌注法,改變瘤胃丙酸產(chǎn)生速率,研究丙酸的瘤胃上皮吸收和向后消化道的流通規(guī)律,為探討瘤胃丙酸發(fā)酵的最優(yōu)控制提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物采用4只帶有瘤胃瘺管和十二指腸瘺管的1.5歲左右的綿羊(來(lái)自內(nèi)蒙古紅格塔拉種畜場(chǎng)),體重為28.8±2.1kg。1.2羊草粉飼料的制備精料補(bǔ)充料組成:玉米70%,小麥麩7%,芝麻餅15%,國(guó)產(chǎn)魚(yú)粉5%,骨粉2%,微量元素預(yù)混料0.68%,復(fù)合多維0.02%,以及食鹽0.25%。粗飼料為羊草,日糧粗精比為54∶46,粗料長(zhǎng)不超過(guò)5mm,以保證其在瘤胃發(fā)酵均勻。粗、精料分開(kāi)飼喂,每3h飼喂1次,且先投粗料,后喂精料,盡可能模擬連續(xù)飼喂。1.3精、粗飼料喂量按中國(guó)美利奴羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(1985)計(jì)算每天的精、粗飼料喂量,綿羊的能量維持需要為450kJ/kgW0.75,蛋白質(zhì)維持需要為350mgN/kgW0.75,飼養(yǎng)水平為1倍維持需要。1.4試驗(yàn)溶液的使用試驗(yàn)羊在預(yù)飼期間和試驗(yàn)期間均放進(jìn)代謝籠中飼喂,晚上給予連續(xù)光照便于采食,并保證自由飲水,但試驗(yàn)期間停止供水而用灌注的試驗(yàn)溶液滿足水的需要。預(yù)飼期至少1周。1.5丙酸鈉基本產(chǎn)生率的計(jì)算1.5.1新的穩(wěn)態(tài)下瘤胃丙酸基本產(chǎn)生速率的確定計(jì)算瘤胃內(nèi)VFA產(chǎn)生速率的前提是瘤胃VFA的產(chǎn)生速率與它們從瘤胃的消失率保持平衡即所謂穩(wěn)態(tài),然后通過(guò)啟動(dòng)灌注和連續(xù)灌注VFA的方法,打破瘤胃的穩(wěn)態(tài)使其濃度變化,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間又達(dá)到新的穩(wěn)衡狀態(tài)。通過(guò)瘤胃某VFA濃度的變化計(jì)算VFA的基本產(chǎn)生速率(mmol/h)。假定丙酸的基本產(chǎn)生速率為P(mmol/h),用U(mmol/h)代表丙酸的消失速率,C(mmol/L)代表基本穩(wěn)態(tài)下瘤胃中丙酸的濃度。當(dāng)瘤胃VFA產(chǎn)生處在穩(wěn)態(tài)下,可假定瘤胃丙酸的消失與丙酸的庫(kù)容量(Poolsize)成正比,可得出如下平衡方程:P=U=kCV(1)式中:k(/h)為比例常數(shù);V(ml)為瘤胃液相體積。通過(guò)向處在基本穩(wěn)態(tài)的瘤胃連續(xù)灌注一定濃度的丙酸溶液打破其穩(wěn)態(tài),并假定灌注丙酸的連續(xù)恒定速率為I(mmol/h),如果VFA的灌注不改變瘤胃基本發(fā)酵模式,則新的穩(wěn)態(tài)方程為:P+I=U′=kC′V′(2)式中,U′、C′、V′分別表示新的穩(wěn)態(tài)下丙酸的消失速率、丙酸的濃度和瘤胃液相體積。將方程(2)減去方程(1)得到比例常數(shù)k:k=I/(C′V′-CV)(3)用k值取代(1),則得到穩(wěn)態(tài)下丙酸的基本產(chǎn)生速率:P=I/(C′V′/CV-1)(4)由于上式中C′、C、V、V′均可測(cè)定。因此可用式(4)計(jì)算丙酸的基本產(chǎn)生速率。1.5.2瘤胃液相體積本試驗(yàn)采用瘤胃全排空法測(cè)定。綿羊自由飲水,并連續(xù)飼喂1周后,用真空泵抽空瘤胃前,向瘤胃灌注一定量(2L)的MacLeod等(1984)緩沖液(每升水中含NaHCO3,KHCO3和NaCl各78,38和7g),且最好加熱緩沖液使其溫度接近瘤胃液的溫度(37℃左右),然后迅速用瘤胃取樣管(長(zhǎng)0.5m)充分?jǐn)噭蛄鑫竷?nèi)容物后,用真空泵抽出。將抽出的內(nèi)容物用小型脫水機(jī)分離食糜和液體約5min,從測(cè)得的液體體積中減去灌注的緩沖液的體積,即為瘤胃液相體積。最后迅速將食糜和除去一定體積后的液體人工混勻成粘稠狀迅速灌入瘤胃。本研究取不同時(shí)間點(diǎn)(采食前后)測(cè)兩次,取平均值作為穩(wěn)態(tài)下瘤胃液相體積。1.5.3瘤液丙酸含量在用全排空瘤胃法測(cè)定瘤胃液相體積后,繼續(xù)模擬連續(xù)飼喂1周,第8天開(kāi)始全天采樣,每4h采集瘤胃液一次,共采6次,求其丙酸濃度均值,即為方程(4)中的C值。1.5.4穩(wěn)定性條件:新的濃度水平啟動(dòng)灌注的目的是為了迅速提高瘤胃的丙酸濃度達(dá)到一個(gè)新的濃度水平,并接上連續(xù)灌注后在較短的時(shí)間內(nèi)趨向新的穩(wěn)定狀態(tài)。同時(shí)也使液相中標(biāo)記物的濃度趨于穩(wěn)定。表1列出了啟動(dòng)灌注液中有關(guān)指標(biāo)的計(jì)算結(jié)果。1.5.5灌注時(shí)定位連續(xù)灌注的目的是為了使瘤胃的丙酸濃度在啟動(dòng)灌注后穩(wěn)定在一個(gè)新的濃度水平,同時(shí)使液相中標(biāo)記物的濃度趨于穩(wěn)定。表2列出了連續(xù)灌注液的各種指標(biāo)。1.5.6瘤液的采集和處理晨6:00開(kāi)始啟動(dòng)灌注,用100ml注射器將分別配制好的啟動(dòng)液迅速灌入瘤胃后,用取瘤胃液樣管在瘤胃中充分?jǐn)噭?緊跟著連續(xù)灌注,3h后開(kāi)始從瘤胃和小腸取樣:取瘤胃液從9:30開(kāi)始,每隔30min取樣1次,直到16:30結(jié)束;取小腸液從10:00開(kāi)始,每隔2h取樣1次。瘤胃液的pH值每小時(shí)測(cè)定1次。連續(xù)灌注丙酸溶液在16:30采樣后停止,接著灌注水溶液,灌注的速率不變。在停止灌注丙酸溶液后,每小時(shí)采集瘤胃液1次,直至20:30結(jié)束并停止水的灌注。然后讓羊自由采食,至此采樣結(jié)束。1.6提高丙酸產(chǎn)量的試驗(yàn)1.6.1啟動(dòng)灌注液中丙酸濃度的確定安排5個(gè)處理,每個(gè)處理代表一個(gè)灌注的丙酸水平(RPP,mmol/h)和一次灌注試驗(yàn)。在每一試驗(yàn)中,同測(cè)定穩(wěn)態(tài)下丙酸基本產(chǎn)生速率一樣,由啟動(dòng)灌注和連續(xù)灌注兩過(guò)程組成。啟動(dòng)灌注液中丙酸濃度的確定原則是通過(guò)灌注啟動(dòng)液后使瘤胃液中丙酸的濃度提高到期望的水平,然后通過(guò)連續(xù)灌注使瘤胃丙酸濃度穩(wěn)定在一新的較高的水平。表3列出了不同處理下啟動(dòng)液和連續(xù)灌注液的具體配制情況。1.6.2灌注液ph的確定為提高丙酸產(chǎn)生速率的丙酸溶液的配制仍使用Macleod等緩沖液,調(diào)整灌注液的pH至大約5.7,灌注速率與羊平均的自由飲水速率相當(dāng)。樣品的收集與測(cè)定丙酸基本產(chǎn)生量略有區(qū)別,即瘤胃液收集的時(shí)間間隔從每隔0.5h延長(zhǎng)至1h,小腸液每2h收集1次。1.7偏磷酸溶液內(nèi)標(biāo)法測(cè)定vfa1.7.1瘤胃液樣品處理:采集的瘤胃液立即用4層紗布過(guò)濾,取5ml瘤胃液和1ml25%的偏磷酸溶液混勻,靜置30min,3000r/min下離心10min,直接上機(jī)用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定VFA或放-20℃冰箱保存,供以后測(cè)定。1.7.2VFA測(cè)定用內(nèi)標(biāo)法,標(biāo)記物Co用原子吸收法測(cè)定,pH用酸度計(jì)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定。1.8瘤胃液相體積測(cè)定丙酸在瘤胃的消失速率(DIS,mmol/h):DIS(mmol/h)=產(chǎn)生速率(PROD,mmol/h)-流通速率(PSG,mmol/h)(5)丙酸產(chǎn)生速率(PROD,mmol/h):PROD(mmol/h)=丙酸基本產(chǎn)生速率(mmol/h)+連續(xù)灌注速率(mmol/h)(6)丙酸流通速率(PSG,mmol/h):PSG(mmol/h)=提高丙酸產(chǎn)量后穩(wěn)態(tài)下丙酸濃度*Co灌注速率(mg/h)/穩(wěn)態(tài)下液相中Co的濃度(mg/L)(7)瘤胃液相流通速率(FRORL,L/h):FRORL(L/h)=Co灌注速率(mg/h)/穩(wěn)態(tài)下液相中Co元素濃度(mg/l)(8)丙酸停止灌注后,瘤胃液相的小數(shù)稀釋速率(KL,/h)由下列指數(shù)曲線計(jì)算:Co(t)=Co(0)*Exp(-KL*t)(9)標(biāo)記法測(cè)瘤胃液相體積(VL)的計(jì)算公式:VL=瘤胃液相的流通速率(L/h)瘤胃液相的稀釋速率(/h)(10)VL=瘤胃液相的流通速率(L/h)瘤胃液相的稀釋速率(/h)(10)2結(jié)果2.1腫瘤胃基本穩(wěn)定條件及基本產(chǎn)生率的計(jì)算結(jié)果2.1.1灌注時(shí)間和連續(xù)灌注時(shí)間對(duì)瘤胃ph的影響在啟動(dòng)灌注后,瘤胃內(nèi)pH短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)一定程度的上升,其后隨著連續(xù)灌注時(shí)間的延續(xù),大約在啟動(dòng)灌注4h后,瘤胃pH開(kāi)始趨于穩(wěn)定。動(dòng)物個(gè)體間pH變異系數(shù)<0.5%。2.1.2丙酸鈉對(duì)腫瘤胃的濃度變化大約在啟動(dòng)灌注(晨6:00)后5h后,瘤胃內(nèi)丙酸濃度開(kāi)始趨于穩(wěn)定,動(dòng)物個(gè)體間變異系數(shù)均<6%。2.1.3co-印度穩(wěn)定下腫瘤標(biāo)記物質(zhì)的濃度變化在啟動(dòng)灌注后仍出現(xiàn)短時(shí)間的Co濃度的升高,而后在連續(xù)灌注的維持下,瘤胃標(biāo)記物濃度趨于穩(wěn)定,動(dòng)物個(gè)體間變異系數(shù)均<5%。2.1.4丙酸產(chǎn)生速率和丙酸消失速率按穩(wěn)態(tài)下瘤胃各種特性指標(biāo)計(jì)算公式[式(5)~(10)],計(jì)算得到連續(xù)飼喂條件下,且瘤胃丙酸濃度趨于穩(wěn)定時(shí),瘤胃內(nèi)各種液相特性指標(biāo)及丙酸的有關(guān)參數(shù)列于表4。表4表明,丙酸在瘤胃穩(wěn)態(tài)下的基本產(chǎn)生速率為22.4mmol/h,加上連續(xù)灌注的丙酸數(shù)量,則總的丙酸產(chǎn)生速率為34.2mmol/h。其中每小時(shí)有23.4mmol丙酸被吸收,即產(chǎn)生丙酸的68.3%被瘤胃吸收。產(chǎn)生的丙酸向瘤胃后消化道的周轉(zhuǎn)量為10.8mmol/h,占丙酸產(chǎn)生量的31.4%。丙酸產(chǎn)生速率、丙酸消失速率和丙酸的小數(shù)消失率的變異均較小,CV分別為1.9%,4.9%和3.2%。此外,瘤胃液相外流速率為0.253L/h,由標(biāo)記物估測(cè)的瘤胃液相體積為2.49L,與本試驗(yàn)灌注前通過(guò)人工全排空瘤胃內(nèi)容物測(cè)定的瘤胃體積非常接近,恰好證實(shí)了兩種方法的可行性;還測(cè)得了瘤胃液相小數(shù)外流速率為0.101/h。2.2瘤胃液相標(biāo)記物co與丙酸發(fā)現(xiàn)速率的關(guān)系2.2.1提高丙酸產(chǎn)生速率與穩(wěn)態(tài)下瘤胃pH、丙酸濃度及標(biāo)記物濃度的關(guān)系:通過(guò)連續(xù)灌注丙酸得到5個(gè)不同丙酸產(chǎn)生水平(處理),獲得的穩(wěn)態(tài)下瘤胃內(nèi)液相pH、丙酸濃度及液相中Co元素濃度及均值和變異系數(shù)見(jiàn)表5。瘤胃丙酸產(chǎn)生速率對(duì)瘤胃液相pH的影響:瘤胃丙酸產(chǎn)生速率PROD(mmol/h)與瘤胃pH呈線性關(guān)系,對(duì)所有處理進(jìn)行回歸分析得如下結(jié)果:pH=6.87-0.0059·PROD(mmol/h)(R2=0.96,P=0.0028,CV=0.86%)(11)瘤胃丙酸產(chǎn)生速率對(duì)瘤胃丙酸濃度的影響:對(duì)不同處理間的均值作回歸處理得到瘤胃丙酸濃度CON丙酸(mmol/L)與PROD(mmol/h)的線性模型如下:CON丙酸(mmol/L)=3.41+1.079·PROD(mmol/h)(R2=0.99,P=0.001,CV=2.86%)(12)丙酸產(chǎn)生速率對(duì)瘤胃液相標(biāo)記物Co濃度的影響:隨著丙酸產(chǎn)生速率的增加,瘤胃液相中Co濃度呈線性下降趨勢(shì),對(duì)不同處理間的均值作回歸處理得到瘤胃Co元素濃度Co(mg/L)與PROD(mmol/h)的回歸模型如下:Co(mg/L)=18.57-0.038·PROD(mmol/h)(R2=0.9652,P=0.003,CV=2.32%)(13)2.2.2丙酸產(chǎn)生速率對(duì)丙酸流通速率、丙酸消失率(即吸收率)及液相外流速率等之間的數(shù)量關(guān)系及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,見(jiàn)表6。丙酸產(chǎn)生速率對(duì)丙酸消失率的影響:對(duì)5個(gè)處理的丙酸絕對(duì)消失速率(mmol/h)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明:丙酸產(chǎn)生速率極顯著影響丙酸消失速率(P=0.0001),多重均值檢驗(yàn)(DUNCAN檢驗(yàn))表明,處理間差異顯著。且瘤胃丙酸產(chǎn)生速率與丙酸消失率的數(shù)量關(guān)系如下:DIS(mmol/h)=-0.8+0.705·PROD(mmol/h)(R2=0.99,P=0.001,CV=1.59%)(14)丙酸產(chǎn)生速率對(duì)丙酸小數(shù)消失率的影響:丙酸產(chǎn)生速率的增加對(duì)丙酸小數(shù)消失速率(/h)無(wú)顯著影響(P>0.05)。丙酸產(chǎn)生速率對(duì)瘤胃液相外流速率(RFL,L/h)的影響:隨著丙酸產(chǎn)生量增加,瘤胃液相外流速率(L/h)也隨之有一定程度增加,兩者呈線性關(guān)系(R2>0.90)。不同處理間丙酸產(chǎn)生速率(mmol/h)與RFL(L/h)的線性方程為:RFL(L/h)=0.2205+0.000255·PROD(mmol/h)(R2=0.9327,P=0.0076,CV=1.39%)(15)丙酸產(chǎn)生速率對(duì)瘤胃液相稀釋速率(/h)無(wú)明顯變化(P=0.67)。丙酸產(chǎn)生速率對(duì)瘤胃液相體積(VL,L)的影響:隨著丙酸產(chǎn)生量的增加,瘤胃液相外流速率(L)也隨之有一定程度增加,但是處理間均值差異不顯著(P=0.373)。2.3瘤胃丙酸對(duì)pdr的影響丙酸在十二指腸中的流通量的計(jì)算:PDR(mmol/h)=穩(wěn)態(tài)下十二指腸中丙酸濃度(mg/L)*Co灌注速率(mg/h)/穩(wěn)態(tài)下液相中Co的濃度(mg/L)丙酸在十二指腸中的各種特性指標(biāo)的計(jì)算結(jié)果均列在表7中。丙酸產(chǎn)生速率對(duì)PDR的影響:表7數(shù)據(jù)表明,隨著瘤胃丙酸產(chǎn)生速率的增加,在小腸液中的丙酸流通量也有小幅度增加,兩者成線性關(guān)系(R2>0.99,P=0.001)。將進(jìn)入十二指腸丙酸的流通量轉(zhuǎn)換為占進(jìn)入后消化道總的丙酸的比例后,所得數(shù)據(jù)列在表7中。對(duì)轉(zhuǎn)化后的小數(shù)比例數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明,瘤胃丙酸產(chǎn)生速率對(duì)這一比例影響不顯著(P=0.197),說(shuō)明小腸中丙酸的流通量占整個(gè)流入后消化道的丙酸總量的比例基本恒定,不受瘤胃丙酸產(chǎn)生量多少的影響。由此間接反映了羊的瓣胃和真胃具有對(duì)丙酸較強(qiáng)的吸收能力,能夠除去來(lái)自瘤網(wǎng)胃96%~98%的丙酸。3非灌注狀態(tài)下瘤胃vfa的變化通常一日2次的飼喂制度反映了正常的生理干擾,表現(xiàn)在引起瘤胃VFA濃度、液相流通速率及瘤胃液體積等指標(biāo)的變化,往往給定量研究帶來(lái)困難。本研究依賴選擇合適的動(dòng)物、模擬連續(xù)飼喂和數(shù)學(xué)模型來(lái)評(píng)定動(dòng)態(tài)的、且不能直接測(cè)定的生物過(guò)程。具體操作是按維持飼喂?fàn)I養(yǎng)水平,精、粗飼料比為44∶56,并等份按8次飼喂而獲得。其結(jié)果用做定義丙酸濃度的穩(wěn)態(tài)條件。借助于測(cè)定穩(wěn)態(tài)下在不同測(cè)定部位的丙酸濃度和標(biāo)記物Co元素濃度,利用瘤胃消化動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型估測(cè)丙酸的消失率、流通量及液相流通量和體積等成為可能。測(cè)定丙酸在瘤胃部位的產(chǎn)生量要求在瘤胃發(fā)酵穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下進(jìn)行。而在非穩(wěn)態(tài)下進(jìn)行的丙酸產(chǎn)量的研究報(bào)道較少出現(xiàn)一致的結(jié)果。本研究中給動(dòng)物飼喂54%的干草混合日糧,測(cè)得的瘤胃內(nèi)源丙酸產(chǎn)生速率為22.4mmol/h,折算為日產(chǎn)丙酸的數(shù)量為538.3mmol/d。而穩(wěn)態(tài)下(非灌注狀態(tài)下)瘤胃VFA的摩爾比例為54.38∶27.87∶17.75,轉(zhuǎn)化為瘤胃乙、丙、丁酸的產(chǎn)量為293,150和96mmol/d,則VFA的總能為693.94KJ,占每日攝入代謝能的15.4%左右,比Peters等用肉牛研究報(bào)道的值高約2個(gè)百分點(diǎn)。由于丙酸的碳原子與其它VFA之間的交換已經(jīng)定量不顯著,所以本研究用穩(wěn)態(tài)下非標(biāo)記酸灌注確定的丙酸產(chǎn)生速率能反映瘤胃丙酸的產(chǎn)生速率。盡管Bath等推測(cè)未緩沖的VFA的灌入不會(huì)改變瘤胃VFA的發(fā)酵模式,但是Peters用體外法的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)液的pH值從6.7降至5.7時(shí),明顯降低丙酸的產(chǎn)生量。因此,本研究灌入通過(guò)MacLeod緩沖液緩沖過(guò)的丙酸溶液,其目的是減少瘤胃內(nèi)源發(fā)酵模式程度至最小,尤其保證當(dāng)灌入的丙酸速率與瘤胃的基本